P-ezrin通过p38MAPK信号通路介导乳腺癌转移

作     者：卢一艳 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋敏

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：p-p38 p-ezrin 乳腺癌 转移 

摘      要：前言 埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin,ERM)蛋白家族通过组成膜细胞骨架相关复合体和特殊膜结构对细胞活动进行调节,在肿瘤的侵袭转移中起了重要的作用。细胞骨架连接蛋白ezrin属于ERM家族成员之一,定位于6q25.2-6q26编码基因为villin2。新近研究发现ezrin高表达与多种恶性肿瘤的侵袭转移呈正相关。细胞内ezrin通过N端与C端相互作用,形成头尾连接的折叠状态遮蔽了分子表面的结合位点,处于失活状态。Fievet等发现Thr567磷酸化和PIP2共同参与ezrin活化,活化的ezrin通过连接F-肌动蛋白丝与胞膜的CD44,E-钙黏附蛋白(E-cadherin),细胞间黏附分子1/2(Intercellular adhesion molecule1/2,ICAM1/2)等发挥功能。 探讨ezrin上下游调控分子,这些与调控有关的分子将会成为治疗肿瘤转移的关键。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)是细胞的主要信号传导系统之一,p38MAPK属于MAPK的一个亚族,它通过磷酸化作用改变下游因子的表达,参与多种胞内信息传递过程。多种生长因子、炎症因子和应激反应可激活p38MAPK,p38MAPK激活后可使多种转录因子活化,影响基因转录、蛋白合成,细胞能动性和细胞骨架结构改变,在细胞侵袭、转移方面具有重要的调控功能。综上p38和ezrin只有都磷酸化后才能行使后续功能,目前关于p-p38,p-ezrin两者在介导乳腺癌转移方面的研究,国内外鲜有报道。 Mengdong Lan等研究发现小鼠永生性肝细胞系中ezrin蛋白通p38MAPK信号通路的磷酸化参与微绒毛的形成,这说明p38与ezrin可能存在着一定的联系,但是作者认为:1:转染raf-1基因的小鼠肝细胞中snail表达上调E-caherin,ezrin表达下调,微绒毛缩短,小鼠肝细胞发生上皮间质转,细胞间黏附变弱而易发生转移。2:加入p38抑制剂SB203580后,ezrin,p-ezrin,E-cadherin表达上调,微绒毛变长变粗,而snail表达下调,不易发生转移。然而我们认为:p38MAPK信号通路可能参与ezrin C端(Thr567)的磷酸化,使p-ezrin上调,微绒毛变长变粗,从而增强肿瘤的侵袭转移能力。为此本实验在回顾乳腺癌中p-ezrin和p-p38表达的基础上,着重研究两者在乳腺癌细胞系中的关系。探讨p38MAPK通路是否参与ezrin C端(Thr567)的磷酸化,影响p-ezrin蛋白表达,微绒毛的形成。为乳腺癌复发转移的治疗提供新的理论依据。 材料和方法 1、材料 (1)临床资料80例乳腺癌组织,取自于中国医科大学附属第一医院2001年1月至2007年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。80例均为乳腺浸润性导管癌(IDC),TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例,Ⅲ-Ⅳ期29例。有淋巴结转移33例;收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为IDC,有淋巴结转移为13例,20例为乳腺纤维腺瘤。 (2)细胞系三种人乳腺细胞系(MCF-10A为乳腺正常上皮细胞系,MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系,MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系)原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。 (3)主要试剂抗人p-p38单克隆抗体(#9216)和兔抗人p-ezrin单克隆抗体(#3149)购自Cell signaling公司。p38MAPK特异性抑制剂SB203580(#559398)购自美国Calbiochem公司,于-20℃保存待用。异硫氰四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin)购自Sigma公司,Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。 2、方法 (1)免疫组织化学技术80例标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-peroxidase,S-P)按说明书行免疫组化染色。p-p38稀释比例为1∶200,p-ezrin稀释比例为1∶50;以PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。 (2)Western blot技术总蛋白从组织、生长到对数期收集的细胞及不同浓度的SB203580(0、5、10、20umol/L)处理24小时后的435s细胞中提取。用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白,进行SDS-PAGE和转印,分别孵育一抗(p-p38 1∶400,p-ezrin1∶400稀释)4℃过夜,相应二抗(1∶4000)37℃孵育,ECL发光,