BMP-2通过p38MAPK信号通路抑制VEGF表达的研究

作     者：姚晓慧 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋敏

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺癌 BMP-2 p-p38 VEGF 淋巴结转移 

摘      要：目的 乳腺癌是女性最普遍的恶性肿瘤之一,在发达国家,它位于所有死亡原因的第二位。与前列腺癌相似,乳腺癌也有易发生骨转移的倾向。有研究表明,骨形成蛋白(BMP)在骨肿瘤的发病和转移中起重要作用,其中BMP-2作用尤其明显。肿瘤新生血管的形成是肿瘤发生侵袭和转移的重要因素,许多血管生长因子在肿瘤中均有不同程度的表达。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)是其中效力最强的因子之一,它可直接或间接地参与血管新生的每一个过程。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,,MAPK)家族的重要成员,p38MAPK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。有研究表明,BMP-2可能在VEGF介导的血管生成机制中起重要作用,也有人报道p38MAPK信号传导通路可能调节VEGF上调。因此,本研究检测了p-p38,BMP-2及VEGF在乳腺癌组织中的表达情况,并进一步在体外研究p38MAPK通路与BMP-2的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。 材料与方法 1、材料 68例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科,为2003年～2006年手术切除标本。依据WHO2003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类,68例均为浸润性导管癌。人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s、MCF-7及人正常乳腺细胞系10A购自中国协和医科大学细胞库。 2、主要试剂 兔抗人BMP-2单克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人p-p38单克驴固?#9216)购自Cell Signaling公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(IE-0031)、羊抗鼠(IE-0141)二抗、兔抗人β-actin多克隆抗体(PR-0255)、S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、p-p38特异性抑制剂SB203580、BMP-2特异性抑制剂Nogin、Matrigel胶均自北京中山生物技术有限公司。 3、方法 (1)免疫组织化学步骤:(采用SP法)以PBS代替一抗设立空白对照,以已知乳腺癌阳性片作为阳性对照。结果判定:在双盲法下进行,BMP-2、VEGF以肿瘤细胞胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达,p-p38以肿瘤细胞胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在光镜下随机选取5个视野,每个视野计数100个瘤细胞。着色强度分为无色(-)为0分,浅黄色(+)为1分,黄色及棕黄色(++)为2分。阳性细胞数分为10%为0分,10%-50%为1分,50%为2分。两项得分相乘结果≥2记为阳性。 (2)Western印迹法:RIPA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗及DAB显色,观察拍照,进行灰度值测定。 (3)Transwel法:步骤:用无血清1640以1:3稀释Matrigel,每上室加入Matrigel100微升,37度孵箱中放置了24小时。胰酶消化细胞,细胞计数后稀释至2.5×10cells/ml,取100微升加入上室中,下室加入600微升10%FBS 1640。5%CO37度中培养24小时。固定及染色,切片制作,显微镜下照相并进行细胞计数。 4、统计学分析 采用SPSS10.0统计学软件,进行x检验和t检验,确定p0.05有统计学意义。 结果 1、BMP-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移的关系 应用免疫组织化学染色显示,BMP-2蛋白主要分布于乳腺癌细胞的胞浆内;VEGF蛋白主要分布于乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的胞浆内,乳腺癌细胞浓染,正常乳腺细胞淡染;p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内,呈棕黄色颗粒。31例有淋巴结转移的乳腺癌患者中23例BMP-2表达阳性,阳性率为74.2%,37例无淋巴结转移的患者15例表达阳性,阳性率为40.5%,差异有显著性(p0.01)。VEGF在有淋巴结转移的患者中阳性率为67.7%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为35.1%,差异有显著性(p0.05)。p-p38在有淋巴结转移的患者中阳性率为61.3%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为37.8%,差异有显著性(p0.05)。 2、BMP-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达 Western Blot结果显示BMP-2、p-p38、VEGF在高转移细胞系MDA-MB-435s中的表达高于低转移细胞系MCF-7中的表达高于正常乳腺细胞的表达(p0.05)。 3、加入BMP-2特异性抑制剂Noggin后p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达 Western Blot结果显示加入BM