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纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microrna检测及活细胞成像

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纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microRNA检测及活细...

作者：王帅山东大学

学位级别：硕士

micrornas(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血... 详细信息

micrornas(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等各种疾病密切相关,可作为疾病诊断和预后的潜在标志物。实现细胞内miRNA的可视化检测对于更好地了解其在细胞周期中的作用并进一步阐明其在临床诊断中的生物学功能至关重要。基于以上分析,构建了纳米材料介导的比率荧光生物传感器,实现了miRNA灵敏、准确检测并将其用于细胞成像。本文共分为三章:第一章为绪论,主要概述了 miRNA的产生、形成机制、研究意义以及目前国内外已有的miRNA传统和新型检测方法,并介绍了本文主要解决的科学问题和研究内容。第二章构建了 MnO2纳米片介导的比率荧光生物传感器,并用于miRNA的检测和细胞内成像。该生物传感器由三部分组成:可用作DNA载体的MnO2纳米片、荧光供体FAM标记的发夹探针H1(识别探针)以及荧光受体TAMRA标记的发夹探针H2(放大探针)。当传感器进入细胞后,MnO2纳米片被细胞内谷胱甘肽还原为Mn2+,同时,释放被吸附的发夹探针H1和H2。细胞内目标miRNA-21与H1的识别单元杂交以启动催化发夹自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)并产生大量的H1-H2双链体。这使荧光供体FAM和荧光受体TAMRA相互靠近并产生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),使供体信号降低,受体信号增强,诱导比率荧光响应,从而实现miRNA-21的检测。此外,该方法可以用于区分HeLa、HepG-2和L02细胞中miRNA-21的表达水平。这些结果表明,该生物传感器在miRNA相关疾病的早期诊断中具有很大的应用价值。第三章基于多重FRET构建生物编码荧光传感器,用于miRNA的多重检测和细胞内成像。该传感器由MnO2纳米片和四条单链DNA探针(P1-AF 488、P2-Cy3、P3-AF488和P4-AF594)组成。作为DNA纳米载体,MnO2纳米片可以通过细胞的内吞作用将探针递送进细胞。探针P1-AF 488和探针P2-Cy3序列与miRNA-373部分互补,探针P3-AF 488和P4-AF 594序列与miRNA-96部分互补。当探针被递送进细胞后,在相应目标miRNA的存在下,P1-AF 488和P2-Cy3以及P3-AF 488和P4-AF 594形成双链结构,使供体和受体相互靠近发生FRET,从而使荧光信号发生改变。此外,可以将输出的特定的荧光颜色作为代码,将miRNA的存在情况转换为不同的荧光颜色信号,实现miRNA的多重检测。这些结果表明,该生物传感器为细胞内miRNA的同时检测提供了新工具,有望为癌症的诊断和治疗提供更准确的信息。

关键词： MnO2纳米片比率 microrna检测细胞成像

上转换荧光探针的构建及其在microrna检测和细胞成像中的应用

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上转换荧光探针的构建及其在microRNA检测和细胞成像中的应用

作者：宋淑婷南京大学

学位级别：硕士

Micro RNA是一类长约18-24 nt的内源性非编码RNA,是各种生理过程的重要调控开关。Micro RNA的异常表达与肿瘤的无限增殖、血管生产、免疫逃逸、侵袭、迁移和粘附密切相关,是新兴的肿瘤标志物。因此,micro RNA的快速精准检测对肿瘤疾病... 详细信息

Micro RNA是一类长约18-24 nt的内源性非编码RNA,是各种生理过程的重要调控开关。Micro RNA的异常表达与肿瘤的无限增殖、血管生产、免疫逃逸、侵袭、迁移和粘附密切相关,是新兴的肿瘤标志物。因此,micro RNA的快速精准检测对肿瘤疾病的早期诊断和病理分析具有重大的意义。与基于荧光染料或量子点的纳米探针相比,以稀土上转换纳米材料(UCNPs)为核心的micro RNA纳米探针具有背景荧光小、良好的生物相容性、光稳定性好、发射光谱可调节和大的反斯托克斯位移等优点,但检测灵敏度不足阻碍了其发展和应用。因此,高灵敏的micro RNA上转换荧光纳米探针的研制在肿瘤的早期诊断领域具有重要的应用价值。本论文致力于提高上转换纳米探针的检测灵敏度、实现UCNPs在肿瘤诊治中的应用,结合信号放大策略、纳米组装技术开展新型micro RNA上转换纳米探针的研制,并将其应用于micro RNA的检测和细胞内成像分析中,主要内容如下:1.基于卫星状UCNPs-Au NPs拆解的micro RNA纳米探针的研制设计了一种由核-壳-壳状上转换纳米粒子Na YF@Na YF:Yb,Er@Na YF(UCNPs)和金纳米粒子(Au NPs)组装得到的卫星状micro RNA纳米探针。由发夹H1和b DNA杂交形成锁状DNA(LLD),能够作为连接分子,将Au NPs固定在UCNPs的表面,形成卫星状UCNPs-Au NPs纳米复合结构,导致UCNPs的荧光发射被Au NPs淬灭。此外,LLD能够特异性识别靶标mi R-21,并借助燃料发夹H2完成靶标mi R-21启动的循环反应。在发夹H2的辅助作用下,靶标mi R-21能够反复打开多个LLD,引发Au NPs从UCNPs表面脱落,从而产生高增益荧光信号。将开发的纳米探针用于mi R-21的检测,结果表明该方法的检测限低至0.76 f M,可以实现mi R-21的高灵敏检测。2.基于靶循环放大策略的双通道荧光探针在细胞内成像micro RNA将靶循环放大策略和双通道激发单色荧光相结合,设计了一种双荧光信号的micro RNA上转换纳米探针,可用于细胞内micro RNA的精准成像。由于非共价作用,由FAM-H1和HS-b DNA杂交得到的锁状DNA(FAM-LLD-SH),通过非共价作用组装到PDA-UCNPs表面。之后,通过Au-S键的作用组装Au NPs,从而得到上转换纳米探针。由于荧光共振能量转移(FRET),Au NPs能够淬灭UCNPs和FAM的绿色荧光发射。靶标mi R-21能够改变锁状DNA的结构,引发起Au NPs远离PDA-UCNPs表面。而发夹H2能够将靶标mi R-21替换出来,实现靶循环反应。于是,在488 nm和980 nm激光的激发下,FAM和上转换发光信号会得到显著恢复。该纳米探针能够显著增强micro RNA在细胞内的成像信号强度,并且可以根据成像结果直接辨别正常细胞和肿瘤细胞。3.基于比例荧光分析micro RNA以辅助光动力治疗定位的上转换纳米探针的研制结合UCNPs的近红外激发、Mn O纳米片的DNA负载能力和荧光淬灭能力,以及催发发夹自组装(HCR)的信号放大能力,构建了多功能上转换纳米探针。光敏剂Ce6修饰的介孔二氧化硅(m Si O)成功包裹在UCNPs表面。随后,在UCNPs@m Si O表面进一步包裹Mn O纳米片。包裹的Mn O纳米片能够吸附荧光染料修饰的发夹HP1和HP2。肿瘤细胞内的还原性环境能够促进Mn O发生降解,从而释放发夹HP1和HP2,可用于靶标mi R-21引发的HCR反应。在靶标mi R-21的触发下,HP1和HP2发生HCR反应形成长的DNA双链,拉近荧光基团FAM和TAMRA之间的距离,发生荧光共振能量转移。用488nm激光照射,随着靶标mi R-21浓度的增加,FAM的荧光信号降低而TAMRA的荧光信号增强,即相对荧光强度RFL(RFL=FL/FL)逐渐增加,可实现micro RNA的灵敏检测,并有望为光动力治疗提供定位指导。本论文基于信号放大技术开展了micro RNA上转换纳米探针的设计合成,以实现UCNPs在高灵敏度检测肿瘤相关核酸的应用为研究目标,以期在生物传感和成像等领域发挥积极作用。

关键词：上转换纳米材料信号放大 microrna检测细胞成像上转换纳米探针

末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microrna检测生物传感器的初步研究

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末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microRNA检测生物传感器的初...

作者：崔警予天津大学

学位级别：硕士

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末... 详细信息

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引入到两种生物传感器的开发和设计中,利用TdT无模版依赖聚合、以RNA为引物延伸的DNA聚合酶特性,实现了基因水平疾病标志物mi RNA的高灵敏、高特异检测,主要研究内容如下:(1)基于双酶级联扩增诱导铜纳米粒子自组装新型生物传感器研究。本章利用TdT无模版依赖DNA聚合酶特性,设计了一种基于双酶(TdT/*** QI)级联扩增诱导铜纳米粒子(Cu NPs)自组装新型生物传感器。首先,基于靶标mi RNA序列设计茎环探针和协助探针,该双探针可以特异性识别靶标mi RNA形成稳定DNA三向结构(3-WJ);其次,3-WJ结构触发TdT/*** QI级联扩增以激活Cu NPs自组装,通过检测Cu NPs的荧光强度实现mi RNA精准定量。该方法对帕金森疾病标志物mi RNA153的检测灵敏度可达fmol级别,为mi RNA高灵敏检测及帕金森疾病诊断分析提供了新思路。(2)TdT以RNA为引物延伸特性的初步探究及应用。本章发现TdT以RNA为引物延伸出长链DNA,基于此特性,设计了一种新型mi RNA生物传感器,有效解决了mi RNA序列短导致的引物设计复杂等技术难题。以TdT在mi RNA3’-OH末端延伸出的长链DNA为模版,设计随机序列茎环引物和特异性直链引物进行实时荧光定量反转录PCR扩增(RT-q PCR),构建一种引物设计简单、无需复杂修饰的mi RNA通用型检测方法并成功应用于肝损伤标志物mi RNA122的检测。综上所述,本文基于TdT成功构建了两种生物传感器并将其应用于实际样本检测,拓展了TdT的应用前景,为疾病标志物的检测提供了新策略。

关键词：铜纳米粒子 microrna检测末端脱氧核苷酸转移酶 Nt.BspQI切刻酶 DNA三向结构实时荧光定量反转录PCR

无酶信号放大技术在microrna检测中的应用进展

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山东化工 2022年第16期51卷 121-124页

作者：谢顺军周宏刘树峰青岛科技大学化学与分子工程学院山东青岛266042

无酶的信号放大技术普遍存在于生物传感器中,因为其具有成本低、抗干扰能力强、容易进行设计等优点,被广泛应用于DNA检测、RNA检测以及蛋白检测等领域,尤其是与多种癌症或者其他疾病密切相关的micrornas,能否准确的定量检测显得极为重... 详细信息

无酶的信号放大技术普遍存在于生物传感器中,因为其具有成本低、抗干扰能力强、容易进行设计等优点,被广泛应用于DNA检测、RNA检测以及蛋白检测等领域,尤其是与多种癌症或者其他疾病密切相关的micrornas,能否准确的定量检测显得极为重要。该文章对DNA生物传感器中无酶的信号放大方法进行了分类,并分别介绍了各类方法对microrna检测的应用进展。

关键词：无酶信号放大生物传感器 microrna检测

纳米功能化碳基电化学生物传感器的构建及其对microrna的检测研究

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纳米功能化碳基电化学生物传感器的构建及其对microRNA的检测研究

作者：何从娟重庆大学

学位级别：硕士

癌症是人类健康的一大杀手,其患病率和死亡率逐年提高,攻克癌症也一直是医学上重要的研究课题。因此,有效地推进癌症的早筛查,早诊断和早治疗,对于降低死亡率,进而改善患者生存质量意义重大。随着分子诊断技术的快速发展,液体活检作为... 详细信息

癌症是人类健康的一大杀手,其患病率和死亡率逐年提高,攻克癌症也一直是医学上重要的研究课题。因此,有效地推进癌症的早筛查,早诊断和早治疗,对于降低死亡率,进而改善患者生存质量意义重大。随着分子诊断技术的快速发展,液体活检作为体外诊断的一个分支,成为推进癌症早筛的一项突破性技术。微小核糖核酸（microrna,miRNA）是一类短序列的内源性非编码RNA分子,广泛存在于真核生物细胞中,并在多种生物过程中发挥关键调节作用。众多研究表明,miRNA在多种疾病状态下表达异常,呈现上调或下调的趋势,尤其与癌症的发生与发展密切相关,因而成为肿瘤早期筛查、诊断、预后中的理想生物标志物之一,同时也成为抗癌药物开发的重要靶点。目前,研究人员已经开发出多种miRNA检测方法,但大多都因步骤繁琐、耗时长、需要依赖大型仪器设备以及检测成本高等原因受到一定的局限。近年来,电化学生物传感因其灵敏度高、响应速度快、操作简单以及易于微型化等优点,在生物分子的检测中受到广泛的应用。为了提升传感器的检测性能,常常引入性能优异的纳米材料构建高灵敏的传感界面并结合生物放大技术进行信号放大,以实现靶标的灵敏检测。基于此,本论文利用具有高导电性和催化活性的碳基纳米材料构建纳米功能化碳基电化学生物传感器,并结合DNA等温扩增技术对miRNA-21（miR-21）和miRNA-155（miR-155）进行检测,以期为肿瘤标志物的检测提供新的思路和方法。主要研究内容如下:（1）采用三维（three-dimensional,3D）多孔石墨烯气凝胶（graphene aerogel,GAs）和金纳米颗粒（gold nanoparticle,AuNPs）修饰的玻碳电极（glassy carbon electrode,GCE）为传感电极（AuNPs/GAs/GCE）,结合催化发夹组装（catalytic hairpin assembly,CHA）介导的Y-形DNA纳米结构的双重信号放大策略,构建了无酶的电化学生物传感器并对miR-21进行检测研究。首先,AuNPs/GAs纳米复合材料具有优异导电性和大比表面积,能够加快电极表面的电子转移速率并且提高探针的固定效率。AuNPs/GAs/GCE电极获得的信号增益比AuNPs/GCE高了三倍多,大大提高了传感电极的灵敏度。其次,CHA过程输出了大量的Y-形DNA纳米结构,不仅有利于信号物质亚甲基蓝（methylene blue,MB）的富集,而且促进了靶标的循环,通过双重信号放大作用实现miR-21的高灵敏检测。所构建的传感器对miR-21的检测范围为5 f M～50 n M,检测限低至14.70 a M（S/N=3）。与其他检测方法相比,该传感策略具有较低的检测限。此外,传感器在选择性、重现性和稳定性方面均表现良好,在血清加标回收中也取得了令人满意的回收率,表明所构建的传感器在临床实际应用中具有较大的潜力。（2）将AuNPs/GAs引入3D导电碳纤维纸（carbon fiber paper,CFP）,构建了具有超高导电性和比表面积的3D柔性传感界面（AuNPs/GAs/CFP）,同时结合脱氧核酶（DNAzyme）驱动的3D DNA walker实现一对多的信号输出,通过铁基金属有机框架（Fe-MOF-NH2）的电信号对miR-155进行定量检测。首先,由碳纤维互相交错形成的3D CFP具有极大的比表面积,为电子邃穿提供了丰富的转移通道。经过AuNPs/GAs的修饰以后,AuNPs/GAs/CFP的电极有效活性面积显著增大,是AuNPs/GAs/GCE电极的12.58倍,为探针提供了丰富的固定位点。其次,3D DNAzyme walker将一对一的识别模式转变为一对多的信号输出模式以实现信号放大。所构建的传感器在miR-155的检测中表现出宽线性范围（100 a M～100 n M）,同时检测限低至56.23 a M（S/N=3）。此外,传感器的选择性和重现性均表现良好,在血清加标回收中也显示出良好的回收率,具有较大的临床应用价值。（3）基于铁嵌入的氮掺杂碳纳米管（iron-embedded nitrogen-doped carbon nanotubes,FeCN）修饰的CFP（FeCN/CFP）、核酸分子门控和靶标驱动的多组分核酸酶（MNAzyme）,构建了一种无底物的电催化辅助的均相电化学生物传感器用于miR-21和miR-155的同时检测研究。首先,通过核酸分子的门控效应分别将硫堇（thionine,Thi）和3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）包封在锆基金属有机框架Ui O-66-NH2中,通过靶标驱动的MNAzyme实现Thi和TMB的释放。其次,3D的FeCN/C

关键词：电化学生物传感器 microrna检测碳基纳米材料等温扩增

基于纳米金与纳米银簇间表面等离子增强能量转移效应特异性检测microrna

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分析化学 2017年第12期45卷 2018-2025页

作者：王红亚尹斌成叶邦策石河子大学化学和化学工程学院华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

micrornas（miRNAs）的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金（Au NPs）与纳米银簇（Ag NCs）间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种mi... 详细信息

micrornas（miRNAs）的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金（Au NPs）与纳米银簇（Ag NCs）间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种miRNA定量检测方法。在AuNPs表面组装两种探针（Probe a和Probe b）制备响应元件Probe b-Probe a-Au NP,其中Probe a通过3’端巯基共价偶联到Au NPs表面,此外具有靶标miRNA互补序列、核酸内切酶酶切序列和Probe b互补序列,Probe b为荧光Ag NCs合成模板。靶标miRNA存在时,启动酶级联恒温扩增反应,导致Probe b脱离Au NPs表面,抑制了Probe b为模板合成的Ag NCs与Au NPs间表面等离子增强能量转移效应,使得反应体系荧光信号增强。本方法的检出限为2.5×10;1mol/L,与miRNAs商业化检测试剂盒相比,避免了逆转录反应,而且操作简单,检测成本低,可应用于生物样本中miRNAs分析。

关键词： microrna检测纳米金纳米银簇表面等离子增强能量转移效应

细胞内microrna的超灵敏检测方法研究

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细胞内microRNA的超灵敏检测方法研究

作者：刘文静山东师范大学

学位级别：硕士

microrna(微小RNA)是一类内源性、非编码的RNA分子,其异常表达与包括癌症在内的许多疾病的发生、发展密切相关。microrna已经成为一种用于癌症诊断和治疗的重要生物标志物,同时还可以作为新药物研制的潜在靶标。因此,发展有效的microRN... 详细信息

microrna(微小RNA)是一类内源性、非编码的RNA分子,其异常表达与包括癌症在内的许多疾病的发生、发展密切相关。microrna已经成为一种用于癌症诊断和治疗的重要生物标志物,同时还可以作为新药物研制的潜在靶标。因此,发展有效的microrna检测方法,用于复杂的临床样品中microrna的准确定量,在临床诊断和生物医学研究中具有很大的应用潜力。近几年,酶辅助的循环信号放大策略在microrna检测中得到广泛的应用。双链特异性核酸酶(Duplex-specific nuclease,DSN)是一种能够特异性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,但对单链核酸分子和双链RNA几乎没有活性的一种核酸酶。此外,这种酶具有很好的区分完全和非完全匹配的双链体的能力。DSN可以精确区分10-12 bp的DNA-DNA双链的单核苷酸错配,只有dsDNA大于10 bp、DNA-RNA大于15 bp时,DSN才能产生切割活性。目前,DSN广泛用于全长cDNA富集后均一化操作、基于二代测序的转录组文库构建等,还用于基因组DNA均一化、cDNA缺失和单核苷酸多态性(SNP)的检测、microrna的多重荧光检测以及端粒末端定量检测等。芘(Pyrene)是一种空间上灵敏的荧光染料,当激发态分子相互靠近至很近的距离时,可以形成芘准分子。芘准分子形成时,发射波长从单体发射波长向长波长移动。与传统的分子信标相比,芘准分子具有一个较大的斯托克斯位移(约130nm),即使在高浓度下,也可以避免自猝灭效应带来的影响。另外,芘准分子的形成是一种无猝灭的信号输出,可以有效地消除由不完全猝灭引发的假阳性信号。在生物体液中,与一般的发色团(荧光寿命低于10 ns)相比,芘准分子在波长485nm处具有较长的荧光寿命(高达100 ns)。目前,已经在检测金属离子、核酸、蛋白质等方面得到十分广泛的应用。本论文中,我们提出了一种简单的基于双链特异性核酸酶(DSN)辅助的靶标循环和芘准分子切换的荧光法用于灵敏地检测microrna。我们设计了一个特异性探针和一个发夹探针,其茎的两端用芘分子标记作为报告探针。当靶标microrna存在时,特异性探针与靶标microrna杂交形成探针-microrna双链体,其中的探针链被双链特异性核酸酶(DSN)识别并消化,引发多个探针链的循环-消化过程,因此报告探针保持发夹结构,形成芘准分子。该研究首次使用芘准分子作为信号探针用于microrna的检测,与其他的microrna检测方法相比,具有背景信号低、灵敏度高、特异性强等优势。此外,还可以用于准确定量细胞提取物和血清样品中的microrna分子,在临床诊断和生物医学研究中具有很广阔的应用前景。

关键词： microrna检测酶辅助的循环信号放大策略双链特异性核酸酶芘准分子

基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的构建及其对microrna同步检测及调控的应用研究

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基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的构建及其对microRNA...

作者：余恋雨中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最具破坏性的恶性肿瘤之一,早期筛查和诊断有助于提高患者的五年生存率。但HCC起病隐匿,早期往往无明显症状,容易漏诊或误诊。目前常用的早期筛查肝癌的方法仍为血清学标志物... 详细信息

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最具破坏性的恶性肿瘤之一,早期筛查和诊断有助于提高患者的五年生存率。但HCC起病隐匿,早期往往无明显症状,容易漏诊或误诊。目前常用的早期筛查肝癌的方法仍为血清学标志物辅助检查结合影像学方法,但它们早期诊断的检出率不高对于肝癌的早期治疗价值有限。因此,真正意义上的“早发现”亟待更灵敏特异的肿瘤标志物来及早甄别出早期患者,同时仍需要开发一种更加精确、便捷、高效的方法来提升肿瘤的诊疗效能早期诊断、早期治疗和精准个体化治疗是目前癌症医疗方面的目标,液体活检通过检测肿瘤释放到血液中的循环游离DNA、microrna(miRNA)等核酸分子以及肿瘤血小板(tumor-educated platelets,TEPs)、循环肿瘤细胞、外泌体等结构,能够突破组织病理活检的限制,提高血清学标志物的灵敏度和特异性,同时具有非侵入性检测、均质化肿瘤异质性、可重复性高、耗时较短以及能够实时监测肿瘤的发展变化和治疗效果等优点,在实验室研究和临床实践中发挥着越来越重要的作用。其中,miRNA是一种小、非编码RNA,可以与靶信使RNA(mRNA)特异性碱基互补配对,通过转录后水平负向调控mRNA来调节基因表达和细胞过程,因而可以作为疾病靶向治疗的工具。因此,以miRNA为靶点建立诊疗一体化技术逐渐成为肝癌个体化诊疗最有价值的手段之一。然而,现有的miRNA检测方法如原位杂交、northern blot、数字PCR、荧光定量逆转录PCR、二代测序等技术,通常需要复杂的引物设计、多次温度循环、昂贵的仪器设备以及专业人员的操作,而且无法同时满足高特异度、高灵敏度及原位检测的临床诊疗需求,限制了miRNA在临床上的进一步应用。综上,本研究针对肝癌相关miRNA建立了全新的生物诊疗平台,并对其检测和负反馈调节miRNA能力进行了验证,为液体活检在早期肝癌诊断中的应用提供了新的思路和方法。此外,通过研究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平,为肝癌的早期筛查提供了一定的参考价值。研究目的1.探究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平及其对肝癌的诊断价值;2.结合DNAzyme的变构调节原理和DNA四面体结构的稳定性,设计开发能够同时实现胞内miRNA原位检测和负反馈调控的新型DNA纳米机器,为疾病的同时诊断和治疗提供一种集成的工具。研究方法1.选取肝癌患者15名及同期的健康人群15名,分为肝癌组和健康对照组。采用低速离心法提取受试者血浆中的血小板,采用实时荧光定量PCR检测富血小板悬液中教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量,并采用受试者工作曲线分析它们在肝癌诊断方面的临床价值。2.设计了一个基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器用于细胞内miRNA的同步灵敏检测和负反馈调节。该纳米机器包括一个DNA四面体框架和一个核心的miRNA抑制剂控制的变构DNAzyme。利用DNA四面体框架使DNAzyme和底物在空间上相互接近并且促进DNAzyme的细胞摄取和抗酶降解能力。在DNAzyme的变构调节中,被锁定的四面体DNAzyme(L-tetra-D)和活性四面体DNAzyme(A-Tetra-D)的结构转换受miRNA抑制剂的调节。miRNA抑制剂和靶标的结合可以触发从L-tetra-D到A-Tetra-D的构象变化,后者切割底物并释放荧光用于miRNA的传感。同时,由于miRNA抑制剂与miRNA的互补配对,实现对靶细胞的同步调节。3.通过原子力显微镜和聚丙烯酰氨凝胶电泳对基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的组装进行表征。采用FAM荧光作为输出信号进行荧光检测,进一步优化其检测miRNA的性能,评估其检测的灵敏度和特异性。4.通过细胞毒性实验和激光共聚焦荧光测量方法评估基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器在细胞内的生物相容性、稳定性和检测能力,并应用RT-PCR、蛋白质印迹技术评估下游基因和蛋白(PTEN/PDCD4)的表达量,采用流式细胞术评估细胞凋亡情况,验证其对miRNAs的调控效果。研究结果1.肝癌患者教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量均上调,差异均具有统计学意义(P检测限为0.77 p M,线性范围为1 p M-1 n M,回归方程为:Y=8.191

关键词： DNA纳米技术 microrna检测 DNAzyme DNA四面体靶向调节肝癌教育血小板液体活检

末端转移酶介导的反转录PCR用于检测肝损伤标志物microrna

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末端转移酶介导的反转录PCR用于检测肝损伤标志物microRNA

作者：朴佳芳天津大学

学位级别：硕士

近年来,microrna（miRNA）已经成为一类重要的疾病标志物。实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）是目前应用最广泛的mi RNA检测技术之一,然而,由于mi RNA序列短、含量低、种类多,PCR检测中的引物通常需要复杂的设计或化学修饰以稳定引物与... 详细信息

近年来,microrna（miRNA）已经成为一类重要的疾病标志物。实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）是目前应用最广泛的mi RNA检测技术之一,然而,由于mi RNA序列短、含量低、种类多,PCR检测中的引物通常需要复杂的设计或化学修饰以稳定引物与探针之间或引物之间的杂交。为解决上述问题,本文将末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）引入RT-qPCR体系,我们发现TdT能以RNA为引发物聚合出长链DNA,利用这一特性将mi RNA延伸,再结合反转录PCR扩增技术,可达到对mi RNA灵敏而特异的检测,无需复杂的探针修饰,具体研究内容如下:利用琼脂糖凝胶电泳和荧光标记变性PAGE等手段对RNA引发的TdT聚合性质进行验证,结果表明TdT能以RNA为引发物,以脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为底物合成DNA且利用不同种类d NTPs进行延伸的效率存在差异。将RNA引发的TdT聚合反应与RT-qPCR结合开发出了新型miRNA检测方法,即先利用TdT将miRNA延伸,再利用随机引物和特异性引物进行反转录扩增。结果表明该方法对于microrna-122（miR-122）的检测灵敏度可达到200 zmol,特异性良好;利用该方法验证了对乙酰氨基酚过量导致肝损伤生物标志物miR-122含量上调的现象。此外,设计了以单一dNTP为底物的TdT介导的反转录PCR,进一步探究了RNA引发体系中TdT对四种dNTP的延伸,并将其应用于核酸定量中。综上所述,本文发现了末端转移酶的RNA引发性质并进行了验证,成功构建了基于末端转移酶介导的反转录PCR方法并将其应用于miR-122的检测。本研究在末端转移酶的应用及疾病标志物的检测等方面有着巨大的潜在价值。

关键词： microrna检测末端脱氧核苷酸转移酶实时荧光定量PCR