末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microRNA检测生物传感器的初步研究

作     者：崔警予 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：常津

授予年度：2021年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0802[工学-机械工程] 0836[工学-生物工程] 

主      题：铜纳米粒子 MicroRNA检测 末端脱氧核苷酸转移酶 Nt.BspQI切刻酶 DNA三向结构 实时荧光定量反转录PCR 

摘      要：研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引入到两种生物传感器的开发和设计中,利用TdT无模版依赖聚合、以RNA为引物延伸的DNA聚合酶特性,实现了基因水平疾病标志物mi RNA的高灵敏、高特异检测,主要研究内容如下:(1)基于双酶级联扩增诱导铜纳米粒子自组装新型生物传感器研究。本章利用TdT无模版依赖DNA聚合酶特性,设计了一种基于双酶(TdT/*** QI)级联扩增诱导铜纳米粒子(Cu NPs)自组装新型生物传感器。首先,基于靶标mi RNA序列设计茎环探针和协助探针,该双探针可以特异性识别靶标mi RNA形成稳定DNA三向结构(3-WJ);其次,3-WJ结构触发TdT/*** QI级联扩增以激活Cu NPs自组装,通过检测Cu NPs的荧光强度实现mi RNA精准定量。该方法对帕金森疾病标志物mi RNA153的检测灵敏度可达fmol级别,为mi RNA高灵敏检测及帕金森疾病诊断分析提供了新思路。(2)TdT以RNA为引物延伸特性的初步探究及应用。本章发现TdT以RNA为引物延伸出长链DNA,基于此特性,设计了一种新型mi RNA生物传感器,有效解决了mi RNA序列短导致的引物设计复杂等技术难题。以TdT在mi RNA3’-OH末端延伸出的长链DNA为模版,设计随机序列茎环引物和特异性直链引物进行实时荧光定量反转录PCR扩增(RT-q PCR),构建一种引物设计简单、无需复杂修饰的mi RNA通用型检测方法并成功应用于肝损伤标志物mi RNA122的检测。综上所述,本文基于TdT成功构建了两种生物传感器并将其应用于实际样本检测,拓展了TdT的应用前景,为疾病标志物的检测提供了新策略。