纳米功能化碳基电化学生物传感器的构建及其对microRNA的检测研究

作     者：何从娟 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯长军

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 100214[医学-肿瘤学] 0802[工学-机械工程] 10[医学] 

主      题：电化学生物传感器 microRNA检测 碳基纳米材料 等温扩增 

摘      要：癌症是人类健康的一大杀手,其患病率和死亡率逐年提高,攻克癌症也一直是医学上重要的研究课题。因此,有效地推进癌症的早筛查,早诊断和早治疗,对于降低死亡率,进而改善患者生存质量意义重大。随着分子诊断技术的快速发展,液体活检作为体外诊断的一个分支,成为推进癌症早筛的一项突破性技术。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是一类短序列的内源性非编码RNA分子,广泛存在于真核生物细胞中,并在多种生物过程中发挥关键调节作用。众多研究表明,miRNA在多种疾病状态下表达异常,呈现上调或下调的趋势,尤其与癌症的发生与发展密切相关,因而成为肿瘤早期筛查、诊断、预后中的理想生物标志物之一,同时也成为抗癌药物开发的重要靶点。目前,研究人员已经开发出多种miRNA检测方法,但大多都因步骤繁琐、耗时长、需要依赖大型仪器设备以及检测成本高等原因受到一定的局限。近年来,电化学生物传感因其灵敏度高、响应速度快、操作简单以及易于微型化等优点,在生物分子的检测中受到广泛的应用。为了提升传感器的检测性能,常常引入性能优异的纳米材料构建高灵敏的传感界面并结合生物放大技术进行信号放大,以实现靶标的灵敏检测。基于此,本论文利用具有高导电性和催化活性的碳基纳米材料构建纳米功能化碳基电化学生物传感器,并结合DNA等温扩增技术对miRNA-21（miR-21）和miRNA-155（miR-155）进行检测,以期为肿瘤标志物的检测提供新的思路和方法。主要研究内容如下:（1）采用三维（three-dimensional,3D）多孔石墨烯气凝胶（graphene aerogel,GAs）和金纳米颗粒（gold nanoparticle,AuNPs）修饰的玻碳电极（glassy carbon electrode,GCE）为传感电极（AuNPs/GAs/GCE）,结合催化发夹组装（catalytic hairpin assembly,CHA）介导的Y-形DNA纳米结构的双重信号放大策略,构建了无酶的电化学生物传感器并对miR-21进行检测研究。首先,AuNPs/GAs纳米复合材料具有优异导电性和大比表面积,能够加快电极表面的电子转移速率并且提高探针的固定效率。AuNPs/GAs/GCE电极获得的信号增益比AuNPs/GCE高了三倍多,大大提高了传感电极的灵敏度。其次,CHA过程输出了大量的Y-形DNA纳米结构,不仅有利于信号物质亚甲基蓝（methylene blue,MB）的富集,而且促进了靶标的循环,通过双重信号放大作用实现miR-21的高灵敏检测。所构建的传感器对miR-21的检测范围为5 f M～50 n M,检测限低至14.70 a M（S/N=3）。与其他检测方法相比,该传感策略具有较低的检测限。此外,传感器在选择性、重现性和稳定性方面均表现良好,在血清加标回收中也取得了令人满意的回收率,表明所构建的传感器在临床实际应用中具有较大的潜力。（2）将AuNPs/GAs引入3D导电碳纤维纸（carbon fiber paper,CFP）,构建了具有超高导电性和比表面积的3D柔性传感界面（AuNPs/GAs/CFP）,同时结合脱氧核酶（DNAzyme）驱动的3D DNA walker实现一对多的信号输出,通过铁基金属有机框架（Fe-MOF-NH2）的电信号对miR-155进行定量检测。首先,由碳纤维互相交错形成的3D CFP具有极大的比表面积,为电子邃穿提供了丰富的转移通道。经过AuNPs/GAs的修饰以后,AuNPs/GAs/CFP的电极有效活性面积显著增大,是AuNPs/GAs/GCE电极的12.58倍,为探针提供了丰富的固定位点。其次,3D DNAzyme walker将一对一的识别模式转变为一对多的信号输出模式以实现信号放大。所构建的传感器在miR-155的检测中表现出宽线性范围（100 a M～100 n M）,同时检测限低至56.23 a M（S/N=3）。此外,传感器的选择性和重现性均表现良好,在血清加标回收中也显示出良好的回收率,具有较大的临床应用价值。（3）基于铁嵌入的氮掺杂碳纳米管（iron-embedded nitrogen-doped carbon nanotubes,FeCN）修饰的CFP（FeCN/CFP）、核酸分子门控和靶标驱动的多组分核酸酶（MNAzyme）,构建了一种无底物的电催化辅助的均相电化学生物传感器用于miR-21和miR-155的同时检测研究。首先,通过核酸分子的门控效应分别将硫堇（thionine,Thi）和3,3 ,5,5 -四甲基联苯胺（3,3 ,5,5 -tetramethylbenzidine,TMB）包封在锆基金属有机框架Ui O-66-NH2中,通过靶标驱动的MNAzyme实现Thi和TMB的释放。其次,3D的FeCN/C