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纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microrna检测及活细胞成像

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纳米材料介导的比率荧光生物传感器的构建用于microRNA检测及活细...

作者：王帅山东大学

学位级别：硕士

micrornas(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血... 详细信息

micrornas(miRNAs)是一类短的(约18-24个核苷酸)、内源性、非编码RNA分子。miRNA通过调节mRNA的降解或抑制其翻译调控基因的表达从而调控各种生物过程,包括细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等。大量研究表明,miRNA的异常表达与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病等各种疾病密切相关,可作为疾病诊断和预后的潜在标志物。实现细胞内miRNA的可视化检测对于更好地了解其在细胞周期中的作用并进一步阐明其在临床诊断中的生物学功能至关重要。基于以上分析,构建了纳米材料介导的比率荧光生物传感器,实现了miRNA灵敏、准确检测并将其用于细胞成像。本文共分为三章:第一章为绪论,主要概述了 miRNA的产生、形成机制、研究意义以及目前国内外已有的miRNA传统和新型检测方法,并介绍了本文主要解决的科学问题和研究内容。第二章构建了 MnO2纳米片介导的比率荧光生物传感器,并用于miRNA的检测和细胞内成像。该生物传感器由三部分组成:可用作DNA载体的MnO2纳米片、荧光供体FAM标记的发夹探针H1(识别探针)以及荧光受体TAMRA标记的发夹探针H2(放大探针)。当传感器进入细胞后,MnO2纳米片被细胞内谷胱甘肽还原为Mn2+,同时,释放被吸附的发夹探针H1和H2。细胞内目标miRNA-21与H1的识别单元杂交以启动催化发夹自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)并产生大量的H1-H2双链体。这使荧光供体FAM和荧光受体TAMRA相互靠近并产生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),使供体信号降低,受体信号增强,诱导比率荧光响应,从而实现miRNA-21的检测。此外,该方法可以用于区分HeLa、HepG-2和L02细胞中miRNA-21的表达水平。这些结果表明,该生物传感器在miRNA相关疾病的早期诊断中具有很大的应用价值。第三章基于多重FRET构建生物编码荧光传感器,用于miRNA的多重检测和细胞内成像。该传感器由MnO2纳米片和四条单链DNA探针(P1-AF 488、P2-Cy3、P3-AF488和P4-AF594)组成。作为DNA纳米载体,MnO2纳米片可以通过细胞的内吞作用将探针递送进细胞。探针P1-AF 488和探针P2-Cy3序列与miRNA-373部分互补,探针P3-AF 488和P4-AF 594序列与miRNA-96部分互补。当探针被递送进细胞后,在相应目标miRNA的存在下,P1-AF 488和P2-Cy3以及P3-AF 488和P4-AF 594形成双链结构,使供体和受体相互靠近发生FRET,从而使荧光信号发生改变。此外,可以将输出的特定的荧光颜色作为代码,将miRNA的存在情况转换为不同的荧光颜色信号,实现miRNA的多重检测。这些结果表明,该生物传感器为细胞内miRNA的同时检测提供了新工具,有望为癌症的诊断和治疗提供更准确的信息。

关键词： MnO2纳米片比率 microrna检测细胞成像

末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microrna检测生物传感器的初步研究

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末端脱氧核苷酸转移酶介导疾病标志物microRNA检测生物传感器的初...

作者：崔警予天津大学

学位级别：硕士

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末... 详细信息

研究表明,micro RNA(mi RNA)在多种癌症的诊断和监测中发挥着重要作用,现已成为研究热点。然而,mi RNA具有序列短、种类多、表达量低等特点,传统的检测技术存在化学修饰复杂、引物设计繁琐和检测成本高昂等缺陷。针对上述问题,本文将末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引入到两种生物传感器的开发和设计中,利用TdT无模版依赖聚合、以RNA为引物延伸的DNA聚合酶特性,实现了基因水平疾病标志物mi RNA的高灵敏、高特异检测,主要研究内容如下:(1)基于双酶级联扩增诱导铜纳米粒子自组装新型生物传感器研究。本章利用TdT无模版依赖DNA聚合酶特性,设计了一种基于双酶(TdT/*** QI)级联扩增诱导铜纳米粒子(Cu NPs)自组装新型生物传感器。首先,基于靶标mi RNA序列设计茎环探针和协助探针,该双探针可以特异性识别靶标mi RNA形成稳定DNA三向结构(3-WJ);其次,3-WJ结构触发TdT/*** QI级联扩增以激活Cu NPs自组装,通过检测Cu NPs的荧光强度实现mi RNA精准定量。该方法对帕金森疾病标志物mi RNA153的检测灵敏度可达fmol级别,为mi RNA高灵敏检测及帕金森疾病诊断分析提供了新思路。(2)TdT以RNA为引物延伸特性的初步探究及应用。本章发现TdT以RNA为引物延伸出长链DNA,基于此特性,设计了一种新型mi RNA生物传感器,有效解决了mi RNA序列短导致的引物设计复杂等技术难题。以TdT在mi RNA3’-OH末端延伸出的长链DNA为模版,设计随机序列茎环引物和特异性直链引物进行实时荧光定量反转录PCR扩增(RT-q PCR),构建一种引物设计简单、无需复杂修饰的mi RNA通用型检测方法并成功应用于肝损伤标志物mi RNA122的检测。综上所述,本文基于TdT成功构建了两种生物传感器并将其应用于实际样本检测,拓展了TdT的应用前景,为疾病标志物的检测提供了新策略。

关键词：铜纳米粒子 microrna检测末端脱氧核苷酸转移酶 Nt.BspQI切刻酶 DNA三向结构实时荧光定量反转录PCR

上转换荧光探针的构建及其在microrna检测和细胞成像中的应用

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上转换荧光探针的构建及其在microRNA检测和细胞成像中的应用

作者：宋淑婷南京大学

学位级别：硕士

Micro RNA是一类长约18-24 nt的内源性非编码RNA,是各种生理过程的重要调控开关。Micro RNA的异常表达与肿瘤的无限增殖、血管生产、免疫逃逸、侵袭、迁移和粘附密切相关,是新兴的肿瘤标志物。因此,micro RNA的快速精准检测对肿瘤疾病... 详细信息

Micro RNA是一类长约18-24 nt的内源性非编码RNA,是各种生理过程的重要调控开关。Micro RNA的异常表达与肿瘤的无限增殖、血管生产、免疫逃逸、侵袭、迁移和粘附密切相关,是新兴的肿瘤标志物。因此,micro RNA的快速精准检测对肿瘤疾病的早期诊断和病理分析具有重大的意义。与基于荧光染料或量子点的纳米探针相比,以稀土上转换纳米材料(UCNPs)为核心的micro RNA纳米探针具有背景荧光小、良好的生物相容性、光稳定性好、发射光谱可调节和大的反斯托克斯位移等优点,但检测灵敏度不足阻碍了其发展和应用。因此,高灵敏的micro RNA上转换荧光纳米探针的研制在肿瘤的早期诊断领域具有重要的应用价值。本论文致力于提高上转换纳米探针的检测灵敏度、实现UCNPs在肿瘤诊治中的应用,结合信号放大策略、纳米组装技术开展新型micro RNA上转换纳米探针的研制,并将其应用于micro RNA的检测和细胞内成像分析中,主要内容如下:1.基于卫星状UCNPs-Au NPs拆解的micro RNA纳米探针的研制设计了一种由核-壳-壳状上转换纳米粒子Na YF@Na YF:Yb,Er@Na YF(UCNPs)和金纳米粒子(Au NPs)组装得到的卫星状micro RNA纳米探针。由发夹H1和b DNA杂交形成锁状DNA(LLD),能够作为连接分子,将Au NPs固定在UCNPs的表面,形成卫星状UCNPs-Au NPs纳米复合结构,导致UCNPs的荧光发射被Au NPs淬灭。此外,LLD能够特异性识别靶标mi R-21,并借助燃料发夹H2完成靶标mi R-21启动的循环反应。在发夹H2的辅助作用下,靶标mi R-21能够反复打开多个LLD,引发Au NPs从UCNPs表面脱落,从而产生高增益荧光信号。将开发的纳米探针用于mi R-21的检测,结果表明该方法的检测限低至0.76 f M,可以实现mi R-21的高灵敏检测。2.基于靶循环放大策略的双通道荧光探针在细胞内成像micro RNA将靶循环放大策略和双通道激发单色荧光相结合,设计了一种双荧光信号的micro RNA上转换纳米探针,可用于细胞内micro RNA的精准成像。由于非共价作用,由FAM-H1和HS-b DNA杂交得到的锁状DNA(FAM-LLD-SH),通过非共价作用组装到PDA-UCNPs表面。之后,通过Au-S键的作用组装Au NPs,从而得到上转换纳米探针。由于荧光共振能量转移(FRET),Au NPs能够淬灭UCNPs和FAM的绿色荧光发射。靶标mi R-21能够改变锁状DNA的结构,引发起Au NPs远离PDA-UCNPs表面。而发夹H2能够将靶标mi R-21替换出来,实现靶循环反应。于是,在488 nm和980 nm激光的激发下,FAM和上转换发光信号会得到显著恢复。该纳米探针能够显著增强micro RNA在细胞内的成像信号强度,并且可以根据成像结果直接辨别正常细胞和肿瘤细胞。3.基于比例荧光分析micro RNA以辅助光动力治疗定位的上转换纳米探针的研制结合UCNPs的近红外激发、Mn O纳米片的DNA负载能力和荧光淬灭能力,以及催发发夹自组装(HCR)的信号放大能力,构建了多功能上转换纳米探针。光敏剂Ce6修饰的介孔二氧化硅(m Si O)成功包裹在UCNPs表面。随后,在UCNPs@m Si O表面进一步包裹Mn O纳米片。包裹的Mn O纳米片能够吸附荧光染料修饰的发夹HP1和HP2。肿瘤细胞内的还原性环境能够促进Mn O发生降解,从而释放发夹HP1和HP2,可用于靶标mi R-21引发的HCR反应。在靶标mi R-21的触发下,HP1和HP2发生HCR反应形成长的DNA双链,拉近荧光基团FAM和TAMRA之间的距离,发生荧光共振能量转移。用488nm激光照射,随着靶标mi R-21浓度的增加,FAM的荧光信号降低而TAMRA的荧光信号增强,即相对荧光强度RFL(RFL=FL/FL)逐渐增加,可实现micro RNA的灵敏检测,并有望为光动力治疗提供定位指导。本论文基于信号放大技术开展了micro RNA上转换纳米探针的设计合成,以实现UCNPs在高灵敏度检测肿瘤相关核酸的应用为研究目标,以期在生物传感和成像等领域发挥积极作用。

关键词：上转换纳米材料信号放大 microrna检测细胞成像上转换纳米探针

无酶信号放大技术在microrna检测中的应用进展

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山东化工 2022年第16期51卷 121-124页

作者：谢顺军周宏刘树峰青岛科技大学化学与分子工程学院山东青岛266042

无酶的信号放大技术普遍存在于生物传感器中,因为其具有成本低、抗干扰能力强、容易进行设计等优点,被广泛应用于DNA检测、RNA检测以及蛋白检测等领域,尤其是与多种癌症或者其他疾病密切相关的micrornas,能否准确的定量检测显得极为重... 详细信息

无酶的信号放大技术普遍存在于生物传感器中,因为其具有成本低、抗干扰能力强、容易进行设计等优点,被广泛应用于DNA检测、RNA检测以及蛋白检测等领域,尤其是与多种癌症或者其他疾病密切相关的micrornas,能否准确的定量检测显得极为重要。该文章对DNA生物传感器中无酶的信号放大方法进行了分类,并分别介绍了各类方法对microrna检测的应用进展。

关键词：无酶信号放大生物传感器 microrna检测

基于纳米金与纳米银簇间表面等离子增强能量转移效应特异性检测microrna

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分析化学 2017年第12期45卷 2018-2025页

作者：王红亚尹斌成叶邦策石河子大学化学和化学工程学院华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

micrornas（miRNAs）的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金（Au NPs）与纳米银簇（Ag NCs）间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种mi... 详细信息

micrornas（miRNAs）的灵敏检测对临床诊断具有十分重要的意义。本研究采用偶联DNA聚合酶和核酸内切酶介导的恒温扩增反应实现靶标循环再生的策略,利用纳米金（Au NPs）与纳米银簇（Ag NCs）间表面等离子增强能量转移效应,开发了一种miRNA定量检测方法。在AuNPs表面组装两种探针（Probe a和Probe b）制备响应元件Probe b-Probe a-Au NP,其中Probe a通过3’端巯基共价偶联到Au NPs表面,此外具有靶标miRNA互补序列、核酸内切酶酶切序列和Probe b互补序列,Probe b为荧光Ag NCs合成模板。靶标miRNA存在时,启动酶级联恒温扩增反应,导致Probe b脱离Au NPs表面,抑制了Probe b为模板合成的Ag NCs与Au NPs间表面等离子增强能量转移效应,使得反应体系荧光信号增强。本方法的检出限为2.5×10;1mol/L,与miRNAs商业化检测试剂盒相比,避免了逆转录反应,而且操作简单,检测成本低,可应用于生物样本中miRNAs分析。

关键词： microrna检测纳米金纳米银簇表面等离子增强能量转移效应

基于连接反应的微滴式数字PCR检测单细胞中microrna

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基于连接反应的微滴式数字PCR检测单细胞中MicroRNA

作者：田辉陕西师范大学

学位级别：硕士

microrna是一类内源性的、非蛋白编码的、长度在19-25个碱基的短链RNA,它在调控细胞增殖、分化、凋亡的过程中起着重要的作用。一些microrna的异常表达与多种疾病相关,因此microrna已经成为重要的早期临床诊断标志物。然而,由于序列短... 详细信息

microrna是一类内源性的、非蛋白编码的、长度在19-25个碱基的短链RNA,它在调控细胞增殖、分化、凋亡的过程中起着重要的作用。一些microrna的异常表达与多种疾病相关,因此microrna已经成为重要的早期临床诊断标志物。然而,由于序列短、序列相似性强以及在细胞水平中相对低的表达水平,造成microrna的检测困难。最近,microrna的检测在人类疾病诊断和基础生物学研究中受到了广泛关注。然而,对于microrna的高灵敏度、特异性检测,尤其是对microrna的准确定量检测仍然存在着很大的挑战。另外,哺乳动物的不同细胞间的基因表达存在差异,大量细胞样本中的microrna可能掩盖不同细胞间microrna表达的重要信息。因此,准确定量单细胞中的microrna对microrna表达和细胞功能研究十分重要。综上所述,研究建立一种准确性好、灵敏度高以及操作简便的单细胞中microrna的定量方法是十分必要的。在本论文中,基于连接PCR检测microrna方法特异性好、操作简便的特点,结合微滴式数字PCR（ddPCR）灵敏度高,同时可以准确定量的优势,我们研究建立了一种新的microrna检测方法。以microrna为目标分子,将两个与microrna部分互补的核酸探针的3’和5’端分别用两个RNA碱基和磷酸基团修饰,在T4 RNA ligase 2的催化作用下将两个探针连接。连接产物作为核酸扩增反应的模板进行后续的ddPCR扩增。研究建立的检测方法实现低丰度样品中microrna的定量检测,并且灵敏度高（低至20 aM microrna可以被检测出来）,特异性好,线性范围跨越四个数量级。同时实现了单细胞中microrna的定量检测。该分析方法可以深入研究单细胞水平上microrna是如何影响信号通路和细胞功能的,这对于研究与microrna相关的疾病具有重要的意义。

关键词：连接反应微滴式数字PCR(ddPCR) microrna检测单细胞检测

基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的构建及其对microrna同步检测及调控的应用研究

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基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的构建及其对microRNA...

作者：余恋雨中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最具破坏性的恶性肿瘤之一,早期筛查和诊断有助于提高患者的五年生存率。但HCC起病隐匿,早期往往无明显症状,容易漏诊或误诊。目前常用的早期筛查肝癌的方法仍为血清学标志物... 详细信息

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最具破坏性的恶性肿瘤之一,早期筛查和诊断有助于提高患者的五年生存率。但HCC起病隐匿,早期往往无明显症状,容易漏诊或误诊。目前常用的早期筛查肝癌的方法仍为血清学标志物辅助检查结合影像学方法,但它们早期诊断的检出率不高对于肝癌的早期治疗价值有限。因此,真正意义上的“早发现”亟待更灵敏特异的肿瘤标志物来及早甄别出早期患者,同时仍需要开发一种更加精确、便捷、高效的方法来提升肿瘤的诊疗效能早期诊断、早期治疗和精准个体化治疗是目前癌症医疗方面的目标,液体活检通过检测肿瘤释放到血液中的循环游离DNA、microrna(miRNA)等核酸分子以及肿瘤血小板(tumor-educated platelets,TEPs)、循环肿瘤细胞、外泌体等结构,能够突破组织病理活检的限制,提高血清学标志物的灵敏度和特异性,同时具有非侵入性检测、均质化肿瘤异质性、可重复性高、耗时较短以及能够实时监测肿瘤的发展变化和治疗效果等优点,在实验室研究和临床实践中发挥着越来越重要的作用。其中,miRNA是一种小、非编码RNA,可以与靶信使RNA(mRNA)特异性碱基互补配对,通过转录后水平负向调控mRNA来调节基因表达和细胞过程,因而可以作为疾病靶向治疗的工具。因此,以miRNA为靶点建立诊疗一体化技术逐渐成为肝癌个体化诊疗最有价值的手段之一。然而,现有的miRNA检测方法如原位杂交、northern blot、数字PCR、荧光定量逆转录PCR、二代测序等技术,通常需要复杂的引物设计、多次温度循环、昂贵的仪器设备以及专业人员的操作,而且无法同时满足高特异度、高灵敏度及原位检测的临床诊疗需求,限制了miRNA在临床上的进一步应用。综上,本研究针对肝癌相关miRNA建立了全新的生物诊疗平台,并对其检测和负反馈调节miRNA能力进行了验证,为液体活检在早期肝癌诊断中的应用提供了新的思路和方法。此外,通过研究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平,为肝癌的早期筛查提供了一定的参考价值。研究目的1.探究肝癌患者中肿瘤教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的表达水平及其对肝癌的诊断价值;2.结合DNAzyme的变构调节原理和DNA四面体结构的稳定性,设计开发能够同时实现胞内miRNA原位检测和负反馈调控的新型DNA纳米机器,为疾病的同时诊断和治疗提供一种集成的工具。研究方法1.选取肝癌患者15名及同期的健康人群15名,分为肝癌组和健康对照组。采用低速离心法提取受试者血浆中的血小板,采用实时荧光定量PCR检测富血小板悬液中教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量,并采用受试者工作曲线分析它们在肝癌诊断方面的临床价值。2.设计了一个基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器用于细胞内miRNA的同步灵敏检测和负反馈调节。该纳米机器包括一个DNA四面体框架和一个核心的miRNA抑制剂控制的变构DNAzyme。利用DNA四面体框架使DNAzyme和底物在空间上相互接近并且促进DNAzyme的细胞摄取和抗酶降解能力。在DNAzyme的变构调节中,被锁定的四面体DNAzyme(L-tetra-D)和活性四面体DNAzyme(A-Tetra-D)的结构转换受miRNA抑制剂的调节。miRNA抑制剂和靶标的结合可以触发从L-tetra-D到A-Tetra-D的构象变化,后者切割底物并释放荧光用于miRNA的传感。同时,由于miRNA抑制剂与miRNA的互补配对,实现对靶细胞的同步调节。3.通过原子力显微镜和聚丙烯酰氨凝胶电泳对基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器的组装进行表征。采用FAM荧光作为输出信号进行荧光检测,进一步优化其检测miRNA的性能,评估其检测的灵敏度和特异性。4.通过细胞毒性实验和激光共聚焦荧光测量方法评估基于DNAzyme变构调节的DNA四面体样纳米机器在细胞内的生物相容性、稳定性和检测能力,并应用RT-PCR、蛋白质印迹技术评估下游基因和蛋白(PTEN/PDCD4)的表达量,采用流式细胞术评估细胞凋亡情况,验证其对miRNAs的调控效果。研究结果1.肝癌患者教育血小板源性miRNA-122和miRNA-21的相对表达量均上调,差异均具有统计学意义(P检测限为0.77 p M,线性范围为1 p M-1 n M,回归方程为:Y=8.191

关键词： DNA纳米技术 microrna检测 DNAzyme DNA四面体靶向调节肝癌教育血小板液体活检

基于水凝胶反应微区的microrna高灵敏检测

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基于水凝胶反应微区的microRNA高灵敏检测

作者：吴利娜南京大学

学位级别：硕士

microrna（miRNA）是一类重要的生物标志物,与多种疾病的发生发展密切相关,其高灵敏检测对疾病诊断非常重要。在现有的检测技术中,荧光检测简单、灵敏、选择性高,并可基于光谱性质多样的有机染料实现多组分检测。然而,由于有机染料的可... 详细信息

microrna（miRNA）是一类重要的生物标志物,与多种疾病的发生发展密切相关,其高灵敏检测对疾病诊断非常重要。在现有的检测技术中,荧光检测简单、灵敏、选择性高,并可基于光谱性质多样的有机染料实现多组分检测。然而,由于有机染料的可用功能团有限及高荧光团密度带来的光猝灭问题,界面荧光生物分析的灵敏度进一步提高受到限制。界面水凝胶可以提供一个水反应环境,有效防止了平面界面上高荧光分子密度引起的光猝灭,同时提高了探针分子的负载量,比基于平面的传感平台具有更大优势。此外,水凝胶优越的抗非特异性吸附的性质有利于检测复杂基质中的生物分子。本论文构建水凝胶微区,实现了miRNA的高灵敏检测,主要包括以下两个工作:1.基于水凝胶界面阳离子交换荧光信号放大的miRNA高灵敏检测本章构建了一个基于界面阳离子交换反应和DNA级联放大的荧光水凝胶阵列传感器,实现了对miRNA的高灵敏检测。首先,通过紫外光引发的聚合反应在玻片表面构建羧基化的水凝胶阵列,随后通过酰胺化在水凝胶内修饰上发卡结构的DNA捕获探针。目标分子miRNA-21与捕获探针发生杂交进而打开其发卡结构,加入biotin标记的发卡链H1和H2,水凝胶内的HCR便会自动发生。利用生成的DNA长链上的biotin分子与链霉亲和素SA,CdS-biotin被固定在水凝胶微阵列内。最后加入Ag+和Rhod-5N,在水凝胶阵列上直接进行界面阳离子交换反应。CdS释放出大量的Cd2+与Rhod-5N结合,极大地增强了荧光信号。水凝胶水溶液般的环境消除了荧光猝灭问题且可以直接读出信号,简化了实验操作。该方法可以实现对1 fM到500 pM浓度范围内miRNA-21的检测,检测限是0.835 fM。利用水凝胶抗非特异性吸附的性质,我们可以直接检测10个当量细胞原生裂解液内的miRNA-21。临床血清样品内循环miRNA-21含量的测定结果也和qRT-PCR定量的结果一致。该水凝胶阵列为miRNA高灵敏检测提供了一种新途径,在临床无创诊断中有广阔的应用前景。2.基于细胞膜表面原位聚合反应的水凝胶微球制备及单细胞miRNA定量分析本章构建了一个基于细胞膜表面的原位聚合反应和DNA杂交识别荧光水凝胶微球传感器,以实现对于单个细胞中miRNA的高灵敏定量分析。首先,通过酰胺化将细胞膜表面的氨基丙烯酰化,随后加入聚合物单体和交联剂,在引发剂的作用下,进行原位高分子聚合反应,构建包覆单细胞的水凝胶微球。利用水凝胶微球内大量的氨基功能基团,修饰上可与目标分子特异性识别的DNA捕获探针。当细胞被裂解后释放出目标物,引发核酸杂交事件,随后带有荧光基团的报告DNA通过连接酶的作用结合在DNA捕获探针上,从而引起荧光信号的增强,并利用流式细胞仪进行定量分析。在本工作的前期实验中,我们利用二氧化硅微球模拟细胞进行高分子包覆实验,Zeta电位和荧光结果表明水凝胶可以在微球表面原位生成,并调控了二氧化硅微球的浓度和交联剂的分子量。该荧光水凝胶微球反应微区可实现单细胞水平miRNA的定量分析,对于探究细胞间的异质性有着重要的意义。

关键词：水凝胶 microrna检测杂交链反应阳离子交换荧光放大单细胞

基于原位金属化与RAFT聚合信号放大策略的microrna电化学检测

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基于原位金属化与RAFT聚合信号放大策略的microRNA电化学检测

作者：黄炜博南京理工大学

学位级别：硕士

癌症是人类的梦魇,其危害与日俱增,给社会与个人带来了沉重的负担。早筛查、早诊断、早治疗是对抗癌症最有效的手段。近年来诸多研究表明,micro RNA在肿瘤细胞发生、进展和转移过程中发挥着重要作用,其在早期癌症细胞中的异常表达也早... 详细信息

癌症是人类的梦魇,其危害与日俱增,给社会与个人带来了沉重的负担。早筛查、早诊断、早治疗是对抗癌症最有效的手段。近年来诸多研究表明,micro RNA在肿瘤细胞发生、进展和转移过程中发挥着重要作用,其在早期癌症细胞中的异常表达也早于病理学和影像学上的改变。因而micro RNA是一种极具潜力的癌症分子标志物。开发高灵敏、高特异性的microrna检测方法将为癌症的早期诊断奠定基础。电化学传感器有着检测灵敏高、特异性强、成本适中、易于平台化的优点而备受青睐。良好的信号放大策略可以进一步简化电化学传感器的制备步骤并提升其灵敏度。本文基于原位金属化与可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)两种信号放大策略分别研发了两种电化学传感器,实现对micro RNA的超灵敏分析。主要研究内容如下:1.基于RNA金属化的microrna-21超灵敏电化学检测在本研究中,以呈电中性且杂交能力更强的PNA作为探针捕获目标micro RNA,随后RNA通过静电力吸附钯离子,在还原剂的作用下生成以RNA为模板的纳米钯。RNA金属化构建方式使得传感器可在室温下高效进行,简化了传感器的制备与检测。该传感器具有较高的特异性、灵敏度可被应用于血清样品中micro RNA-21的检测。2.基于血红蛋白介导的RAFT与原位金属化的micro RNA-21超灵敏电化学检测在本研究中,首次将血红蛋白介导的RAFT与钯纳米原位金属化两种信号放大策略相结合用于micro RNA的电化学分析,在传感器达到高灵敏度的同时,避免引入RAFT引发所使用的热、光、电等对目标物的影响。同时以RAFT产生的带电聚合物为模板的金属化的方式将为制造以金属纳米材料为基础的传感器带来更多可能性。在最适条件下,该传感器的检测范围为10 aM至0.1 nM,检出限为1.34 aM。

关键词： microrna检测电化学生物传感金属化可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)