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家蚕30kD特异性变应原的分析、纯化与质谱鉴定

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昆虫学报 2007年第2期50卷 101-105页

作者：刘志刚张杰林格深圳大学过敏反应与免疫学研究所广东深圳518060

以Coca’s提取液分别提取到不同时期家蚕Bombyx mori的粗浸液，利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定其特异性变应原，然后用DEAE-52离子交换层析及切胶纯化出30kD的特异性变应原，再经MALDI—TOF在线联机分析，所得质谱数据进入网站搜... 详细信息

以Coca’s提取液分别提取到不同时期家蚕Bombyx mori的粗浸液，利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定其特异性变应原，然后用DEAE-52离子交换层析及切胶纯化出30kD的特异性变应原，再经MALDI—TOF在线联机分析，所得质谱数据进入网站搜索分析。结果显示：1～5龄家蚕均有20条左右蛋白带，其中5龄家蚕有23条蛋白带，主带有11条（82、79、60、51、46、38、32、30、28、24和18kD）。选用家蚕过敏患者阳性血清进行免疫印迹，1-4龄家蚕均显示出82和79kD的特异性变应原；但只有5龄家蚕的30kD蛋白为特异性变应原，通过离子交换层析和经切胶纯化出30kD蛋白，再经MALDI—TOF—MS鉴定该蛋白为外膜蛋白。提示家蚕不同时期抗原成分有所变化，5龄家蚕新出现的30kD蛋白为特异性变应原。

关键词：家蚕过敏原 SDS-PAGE Western blotting 离子交换层析质谱分析

结核病患者免疫相关基因表达变化的基因芯片研究

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中华结核和呼吸杂志 2005年第5期28卷 301-304页

作者：赵雁林端木宏谨李亮宋长兴赵冰北京市结核病胸部肿瘤研究所国家结核病参比实验室 101149

目的探讨免疫相关基因在结核病患者体内的差异表达。方法应用基因芯片技术和生物信息学方法,对63例单纯结核性胸膜炎患者胸腔积液及其外周血中单核细胞与69例肺癌患者的癌性胸腔积液和其外周血中单核细胞的mRNA表达水平进行分析比较,所... 详细信息

目的探讨免疫相关基因在结核病患者体内的差异表达。方法应用基因芯片技术和生物信息学方法,对63例单纯结核性胸膜炎患者胸腔积液及其外周血中单核细胞与69例肺癌患者的癌性胸腔积液和其外周血中单核细胞的mRNA表达水平进行分析比较,所做的表达谱杂交检测均重复1次并在荧光交换后再重复1次以抑制噪声,对阳性和部分阴性结果进行northernblotting复验。结果在对基因表达谱原始数据进行标准化校正、聚类分析和统计学处理后,发现在626条免疫相关基因中差异表达基因53条,其中与细胞增殖相关的基因16个,与细胞免疫应答相关的基因14个,与信号传导有关的基因20个,其他相关基因3个;在结核病患者胸腔积液淋巴细胞中tnfΑ、iglλ、il-17、il-17r、hladp、lcp-1、tcr-Α、tcr-Β、hsp-75、cxcr4、fyb、hlag、hlaa、il18bp、il2r、ltΒ、il-8、ip-10、mcp-1、il-12、il-12r、il-10、canx、irf2、ifn-Γ、tlr、il-1、il-7、tlr、lsp-1、il1-4共31个基因表达较对照组增高4倍以上,il-4、il-18、il-15、ifg-1、scya-14、ablim、peci、ppid、hsf-2、act-2、maoa、ttid、gatm、tgfb3、insr、thb-d、trap-1、tcr-Γ、tcrΔ、il1-3r、il1-1、igf-1、a2m共22个基因表达水平较对照组降低4倍以上。结论机体抗结核免疫的发生、发?

关键词：结核病患者基因表达变化应用基因芯片技术 northern blotting 免疫相关基因 tnf-A il-17 cxcr4 il-12 il-18 il-15 mRNA表达癌性胸腔积液结核性胸膜炎差异表达基因细胞免疫应答 hla-dp 基因表达水平单核细胞 il-4

生长分化因子8在腓肠肌失神经萎缩过程中的表达变化

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中华创伤杂志 2005年第11期21卷 858-861页

作者：张冬雷刘梅丁斐顾晓松南通大学神经再生重点实验室

目的分析生长分化因子8[growthdifferentiationfactor8,GDF8,又称myostatin(MSTN)]在腓肠肌失神经萎缩过程中的表达变化,初步探讨GDF8在肌萎缩过程中的可能作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Westernblotting,分别检测失神... 详细信息

目的分析生长分化因子8[growthdifferentiationfactor8,GDF8,又称myostatin(MSTN)]在腓肠肌失神经萎缩过程中的表达变化,初步探讨GDF8在肌萎缩过程中的可能作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Westernblotting,分别检测失神经支配不同时间段腓肠肌中GDF8mRNA和蛋白含量,并对肌肉湿重比、肌纤维横截面积(CSA)及形态学特征进行分析比较。结果失神经支配早期(3～7d)腓肠肌中GDF8mRNA迅速上升,随后下降,而相应蛋白无此变化。7d后,GDF8mRNA和蛋白水平又逐渐增高,28d达到高峰,至56d时又显著下降。结论腓肠肌萎缩程度和GDF8mRNA及蛋白水平上升呈负相关,提示GDF8在腓肠肌失神经萎缩过程中起了重要作用,为进一步了解肌萎缩的分子机制、寻求相应的治疗方案提供理论基础。

关键词：肌萎缩去神经支配生长分化因子8 生长分化因子神经萎缩表达变化腓肠肌聚合酶链反应(PCR) blotting Western

鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化

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中国兽医学报 2009年第7期29卷 864-867,881页

作者：蒋红霞陈继荣曾振灵阎化领李旭宁华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达载体pET-41a(+)连接,转化入DH5α感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,... 详细信息

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达载体pET-41a(+)连接,转化入DH5α感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性。结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白。

关键词：鸡毒支原体 PvpA蛋白原核表达 Western blotting

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

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中国生物工程杂志 2007年第8期27卷 14-18页

作者：李铁军康楷宋建宁胡瓒斓 Tong-Chuan He 张秉强张才全重庆医科大学附属第一医院重庆400016 重庆医科大学附属第二医院重庆400010 重庆市第九人民医院重庆400700 Molecular Oncology Laboratory The University of Chicago Medical Center IL60637 USA

目的:应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再... 详细信息

目的:应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern blotting、免疫荧光和Western blotting,观察VEGF表达受抑的程度。结果:成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern blotting、免疫荧光和Western blotting,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论:针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。

关键词： RNA干扰血管内皮生长因子(VEGF) 结肠癌细胞 Northern blotting

禽巴氏杆菌C_(48-1)外膜蛋白H基因与鸡IL-18基因真核共表达载体的构建及表达

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中国兽医学报 2006年第4期26卷 382-384页

作者：曹素芳黄青云韩先干邓宪方华南农业大学兽医学院

根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA 3的序列,设计1对特异性引物,以重组质粒pcDNA 3/IL-18为模板,扩增出具有完整真核表达结构的CM V-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA 3/om pH中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成... 详细信息

根据鸡IL-18和真核质粒pcDNA 3的序列,设计1对特异性引物,以重组质粒pcDNA 3/IL-18为模板,扩增出具有完整真核表达结构的CM V-cIL-18-BGHpA片段。将此片段非定向插入重组表达质粒pcDNA 3/om pH中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定证实成功构建了共表达禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因和鸡IL-18基因的重组表达质粒。将共表达质粒转染Cos7细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及W estern b lotting检测,证明了外膜蛋白H基因及鸡IL-18基因均获得了瞬时表达,为研究禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H的免疫原性和鸡IL-18在基因疫苗中的免疫调节作用奠定了基础。

关键词：外膜蛋白H基因鸡IL-18 丙烯酰胺凝胶电泳 Western blotting

玉米AGPL2蛋白多克隆抗体制备及时空表达分析

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华北农学报 2018年第6期33卷 17-23页

作者：吕亚楠余国武黄玉碧四川农业大学农学院四川成都611130 四川农业大学农学院作物科学实验教学中心四川成都611130

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GS... 详细信息

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

关键词： AGPL2蛋白基因克隆原核表达 Western blotting

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人趋化因子ELC的克隆与表达

第三军医大学学报 2005年第12期27卷 1204-1207页

作者：罗福康沈大斌郑红第三军医大学新桥医院检验科重庆400037 第三军医大学西南医院实验研究中心重庆400038

目的　克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法　从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α... 详细信息

目的　克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法　从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET3 2a(+ ) ELC ,SDS PAGE分析其表达,Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化ELC融合蛋白。结果　成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白。结论　构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白。

关键词： ELC 融合表达载体缺失突变 Western blotting 蛋白纯化

心肌缺血日负荷对新西兰兔血管内皮生长因子表达的影响

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中国康复医学杂志 2005年第3期20卷 165-168页

作者：王骏励建安金挺剑陈子庆顾劲扬王元会南京医科大学第一附属医院康复科南京广州路300号210029 南京医科大学第一附属医院中心实验室

要目的:观察心肌缺血日负荷对新西兰兔血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:健康成年新西兰兔38只,体重2.0—2.5kg。根据日缺血次数随机分为2次/日组、4次/日组、6次/日组、假手术组以及正常组。将气囊梗阻器安装在冠状动脉左室支,... 详细信息

要目的:观察心肌缺血日负荷对新西兰兔血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:健康成年新西兰兔38只,体重2.0—2.5kg。根据日缺血次数随机分为2次/日组、4次/日组、6次/日组、假手术组以及正常组。将气囊梗阻器安装在冠状动脉左室支,制作间断性心肌缺血模型。缺血负荷为2min/h,缺血刺激4周。取缺血区心肌观察形态学变化;Westernblotting方法检测VEGF蛋白在缺血区心肌的表达水平;取兔术前和缺血刺激前、后24h血清检测肌钙蛋白(cTnI)。结果:气囊充气可以有效、迅速地诱发心肌缺血;与假手术组和正常组相比,缺血刺激2次/日组、4次/日组、6次/日组缺血心肌VEGF表达升高(P<0.05),各缺血刺激组间的VEGF表达无差异;各组左室支支配区未见心肌坏死和血栓形成;兔缺血刺激后24h血清肌钙蛋白无明显升高。结论:持续4周的间断性心肌缺血对心肌无损伤,可以显著提高缺血区心肌VEGF表达增加,不同刺激频率对其表达无明显影响。

关键词：新西兰兔血管内皮生长因子(VEGF) blotting VEGF表达 Western 心肌缺血模型 VEGF蛋白血清肌钙蛋白形态学变化性心肌缺血缺血区冠状动脉缺血负荷血清检测气囊充气缺血心肌血栓形成心肌坏死刺激频率正常组