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TaqMan探针实时荧光定量PCR快速鉴定欧洲樱桃绕实蝇

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植物检疫 2022年第3期36卷 39-45页

作者：刘玮琦姜帆李兰陈超孙利东耿俊东郑敏梁靓满洲里海关技术中心内蒙古满洲里021400 中国检验检疫科学研究院阿拉山口海关技术中心西安海关技术中心

为建立快速、灵敏检测欧洲樱桃绕实蝇的实时荧光定量PCR方法,本研究利用欧洲樱桃绕实蝇及其近似种类的线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列差异,设计筛选特异性引物和探针OYF/OYR/OYP,并对引物及探针特异性和灵敏性进行检测。结果表明,设计... 详细信息

为建立快速、灵敏检测欧洲樱桃绕实蝇的实时荧光定量PCR方法,本研究利用欧洲樱桃绕实蝇及其近似种类的线粒体DNA(mtDNA)中COI基因序列差异,设计筛选特异性引物和探针OYF/OYR/OYP,并对引物及探针特异性和灵敏性进行检测。结果表明,设计的引物和探针能够特异性检测出欧洲樱桃绕实蝇,灵敏度为0.001 ng/μL。

关键词：欧洲樱桃绕实蝇 TaqMan探针实时荧光定量PCR 鉴定

实时荧光定量taqman-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

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微生物学通报 2015年第2期42卷 427-435页

作者：栗冬梅刘云彦杜鹏程宋秀平刘起勇中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 山东大学生命科学院山东济南250100

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较C... 详细信息

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。

关键词：杆菌样巴尔通体卡瑞恩病实时荧光定量PCR TaqMan探针生物信息学

基于Taqman探针的CKD相关基因检测荧光定量一步法试剂盒的构建及...

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作者：邱申东南大学

学位级别：硕士

研究背景:慢性肾脏疾病(CKD)是世界上影响人类健康的慢性病之一,目前对慢性肾脏病的诊断仍缺乏有效手段。近年来研究表明,尿液信使RNA(messenger RNA,mRNA)检测可能成为CKD早期无创诊断的有效手段。我们通过生物信息学和基因表达芯片的... 详细信息

研究背景:慢性肾脏疾病(CKD)是世界上影响人类健康的慢性病之一,目前对慢性肾脏病的诊断仍缺乏有效手段。近年来研究表明,尿液信使RNA(messenger RNA,mRNA)检测可能成为CKD早期无创诊断的有效手段。我们通过生物信息学和基因表达芯片的筛查,发现了一系列可能的CKD相关尿液mRNA诊断标志物。然而,既往基于SYBR两步PCR检测尿液mRNA的方法耗时耗力,限制了对候选标志物大样本的临床验证。本研究旨在构建一种基于TaqMan探针荧光定量PCR一步试剂盒,提高尿液mRNA标志物的检测效率、敏感性、特异性,并通过临床样本验证和性能评价,构建CKD尿液mRNA一步法检测试剂盒,发现CKD新型诊断标志物。方法:应用生物信息学技术筛选CKD患者差异表达mRNA,从中选取三个mRNA基因,分别是PODXL、IL1RL1和CCL2。根据目的基因ID,在NCBI上下载PODXL、IL1RL1、CCL2、以及B2M(内参基因)基因全序列,并构建基于TaqMan探针的CKD相关基因检测荧光定量一步法试剂盒,对试剂盒进行敏感性及重复性检验以检测试剂盒性能。筛选符合条件的受试者,收集受试者尿液样本,应用所建试剂盒检测受试者尿液PODXL、IL1RL1及CCL2 mRNA水平并评估标志物的诊断效能。结果:通过对基因组平台大数据库的综合分析,我们构建了常见慢性肾脏病如糖尿病肾病、高血压肾病、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病和IgA肾病等的转录组学表达谱,发现了176个肾小球相关慢性肾脏病差异表达基因、50个肾小管相关差异表达基因。通过对PCR实验中各体系组分及反应条件优化,我们构建的TaqMan探针一步法荧光定量试剂盒可实现尿液中PODXL、IL1RL1和CCL2以及B2M(内参基因)四种mRNA有效扩增及定量检测。经过一系列的重复性及敏感性验证,发现本试剂盒的变异系数小于0.5%,检测性能较稳定,可从0.5ng/10ul体系的尿沉渣mRNA中检测相应mRNA表达水平,灵敏度较好。整个扩增定量全过程在一小时内完成,与传统的两步法PCR方法相比减少了检测时间。应用构建的TaqMan探针一步法试剂盒对既往所筛选的差异基因进行临床验证,发现DKD患者的尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA和CCL2 mRNA水平高于正常对照组(HC)。GN(慢性肾小球肾炎)患者三种基因表达水平和正常组相比无差异。HC组和DKD III期、IV期组尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA表达水平有显著差异。而HC组和DKD各期间CCL2 mRNA表达水平无差异。DKD患者的尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA和CCL2 mRNA表达水平和eGFR、血肌酐无相关性,和24小时尿蛋白、ACR呈显著的正相关。PODXL区分DKD和对照组的ROC曲线下面积AUC为0.7879(pTaqMan探针的实时荧光定量一步法试剂盒对尿液基因表达检测具有较好的敏感性、特异性和可重复性;该试剂盒用于CKD尿液mRNA标志物大样本检测,发现尿液PODXL、IL1RL1和CCL2 mRNA可能成为DKD新型诊断标志物。

关键词：生物信息学尿液mRNA 慢性肾脏病基因芯片荧光定量PCR TaqMan探针

新型鸭呼肠孤病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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河北农业大学学报 2020年第5期43卷 80-84页

作者：张博陈立功武华阴雅洁孟利佳郭康康侯绍华董世山河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

为了快速、准确检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV),本试验采用NDRVσB基因的序列保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了NDRV实时荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验、重复... 详细信息

为了快速、准确检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV),本试验采用NDRVσB基因的序列保守区,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了NDRV实时荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线,并进行特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验。结果表明:所建立的taqman荧光定量RT-PCR检测方法标准曲线方程为y=-3.354x+44.818,扩增效率为98.7%,标准曲线的相关系数为0.999;该方法可以特异性检测NDRV,但对MDRV、ARV、TMUV、DHAV均无反应信号;该方法检测质粒标准品最低检测浓度为10拷贝/μL,是普通PCR方法检测敏感性的1000倍;该方法的组内与组间变异系数均小于2%;用该方法检测临床样品,结果显示NDRV阳性率为45%,而常规RT-PCR阳性率为33%,比常规RT-PCR敏感。说明本研究建立的taqman荧光定量RT-PCR检测方法可为NDRV的监测和早期诊断提供可靠的技术支撑。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒 σB基因荧光定量 RT-PCR TaqMan探针应用

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

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卫生研究 2013年第3期42卷 491-496,519页

作者：袁慕云许龙岩曹际娟阳静张旺陈碧玲相大鹏广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心广州510623 辽宁出入境检验检疫局

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。

关键词：鼠伤寒沙门菌肠炎沙门菌双重荧光PCR TaqMan探针食品

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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中国兽医科学 2018年第4期48卷 403-411页

作者：朱建勋赵萍郝华芳陈胜利翟肖辉刘永生储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 甘肃煤田地质局一三三队甘肃白银730913

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp．capripneumoniae，Mccp）．选择MccparcD基因为靶序列，设计特异性引物和探针，建立并优化反应体系，以Mcep和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为... 详细信息

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp．capripneumoniae，Mccp）．选择MccparcD基因为靶序列，设计特异性引物和探针，建立并优化反应体系，以Mcep和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板，进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测．并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示，仅Mccp有扩增条带（185bp）和明显的荧光扩增信号（Ct值为21．93），其余供试菌株没有扩增条带，且表现出微弱的荧光扩增信号（Ct值均大于31）。普通PCR检测的灵敏度为5．96×10^4copies／pL，而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5．96copies／pL。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1％。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测，结果有2份为Mccp阳性样本．阳性率为2.94％。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种 TaqMan探针实时荧光定量PCR 特异性敏感性

蝗虫微孢子TaqMan探针Real-time PCR检测新方法

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中国生物防治学报 2017年第6期33卷 796-802页

作者：扈鸿霞郑秋英叶小芳赵贝季荣新疆师范大学生命科学学院/新疆特殊环境物种多样性应用与调控实验室/中亚区域跨境有害生物联合控制国际研究中心乌鲁木齐830054

蝗虫微孢子已被广泛运用于蝗虫防治。本研究采用蝗虫微孢子保守性高的小核糖体亚单位RNA为目的基因,将其克隆到pMD18-T载体上构建重组质粒,制备质粒标准品。设计一对特异性引物和TaqMan探针,并对引物浓度、探针浓度分别进行了优化,建立... 详细信息

蝗虫微孢子已被广泛运用于蝗虫防治。本研究采用蝗虫微孢子保守性高的小核糖体亚单位RNA为目的基因,将其克隆到pMD18-T载体上构建重组质粒,制备质粒标准品。设计一对特异性引物和TaqMan探针,并对引物浓度、探针浓度分别进行了优化,建立了蝗虫微孢子taqman实时荧光定量PCR检测方法。该检测方法的灵敏度达1.29×105 copies/L,各浓度质粒标准品的组内和组间重复的变异系数均小于1%。这里建立的蝗虫微孢子TaqMan探针荧光定量PCR检测方法较快速、简便和准确,适用于生产中蝗虫微孢子的快速检测。

关键词：蝗虫微孢子 Real-time PCR TaqMan探针

盖塔病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2020年第7期40卷 1290-1295页

作者：朱翔宇鲁荣光胡博蔡熙姮刘昊史宁中国农业科学院特产研究所吉林长春130112 佛山科学技术学院广东佛山528000

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测盖塔病毒(Getah virus,GETV)的核酸,并初步应用于GETV的临床标本检测。根据GenBank登录的GETV全基因组序列,应用生物学软件进行序列比对,在NSP1保守区设计1对特异性引物和taqman... 详细信息

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测盖塔病毒(Getah virus,GETV)的核酸,并初步应用于GETV的临床标本检测。根据GenBank登录的GETV全基因组序列,应用生物学软件进行序列比对,在NSP1保守区设计1对特异性引物和TaqMan探针。建立实时荧光定量RT-PCR检测GETV的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法能特异性地鉴别检测GETV;检测灵敏度高,检测的最低模板量可以达到2.03×10^1 copies/μL;将收集到的10000只蚊子样品分成100份进行检测,共检测出8份GETV阳性样品,与常规反转录PCR(RT-PCR)检测及病毒分离结果吻合。本研究建立的GETV taqman实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于GETV的临床早期诊断。

关键词： GETV TaqMan探针荧光定量RT-PCR

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

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植物保护 2024年第2期50卷 219-227,239页

作者：孙爱青王丽花张艺萍杨秀梅许凤苏艳云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室国家观赏园艺工程技术研究中心昆明650205 云南大学昆明650091

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标... 详细信息

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒 TaqMan探针 RT-qPCR 兰花