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t7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能

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Acta Genetica Sinica 2000年第5期27卷 455-461页

作者：李月琴朱嘉明李弘剑谢卫兵周天鸿王彤歌暨南大学生物工程系广州5106325 暨南大学附属医院广州510630

根据ａ－鹅膏蕈碱（ａ－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制，以氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）作为报道基因进行体内表达实验，证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ... 详细信息

根据ａ－鹅膏蕈碱（ａ－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制，以氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）作为报道基因进行体内表达实验，证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术，分别以ＴＡＴＡ框、ＣＡＡＴ框、ＧＣ框和八核苷酸序列（ｏｃｔａｍｅｒ）为竞争性寡核苷酸分子，发现人工合成的Ｔ７启动子可能与ＴＦⅡＤ起始转录因子结合，形成ＤＮＡ－核蛋白质结合物。将ＴＡＴＡ框和八核苷酸序列分别接入Ｔ７启动子上游，ＣＡＴ实验显示八核苷酸序列可以增强ＲＮＡ聚合酶Ⅱ对Ｔ７启动子的转录起始作用。实验结果表明Ｔ７启动子可作为ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。

关键词： t7启动子顺式作用因子转录起始真核生物POLⅡ

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t7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统

生物化学与生物物理学报 1996年第5期28卷 87-95页

作者：陈长征段治军杨新颖夏其昌李伯良王应睐中国科学院上海生物化学研究所

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统，这些表达载体会有强的Ｔ７启动子、翻译起始及终止元件、多克隆位点、线状噬菌体复制起始区（ｆ１ｏｒｉ）等元件，使得该载体系统不仅可以有效地表达外源基因，还可以利用ｈｅｌ... 详细信息

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统，这些表达载体会有强的Ｔ７启动子、翻译起始及终止元件、多克隆位点、线状噬菌体复制起始区（ｆ１ｏｒｉ）等元件，使得该载体系统不仅可以有效地表达外源基因，还可以利用ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ诱导包装单链噬菌体，从而不需亚克隆就可以进行突变及ＤＮＡ序列测定。利用上述载体已成功地高效表达了多种外源基因，其中许多外源基因得到了可溶性的活性表达产物，重组蛋白可以成熟蛋白或短融合形式表达。

关键词： t7启动子表达载体大肠杆菌

CMV与t7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

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病毒学报 2012年第3期28卷 237-245页

作者：魏国超田文洪王刚柳云帆尉迟捷董小岩凌虹吴小兵哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150081 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 吉林大学生命科学学院长春130012 北京五加和分子医学研究所北京100176

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与t7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader... 详细信息

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与t7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和t7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR t7/5细胞(稳定表达t7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与t7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或t7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pt7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR t7/5细胞,结果pt7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅t7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了t7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。

关键词： t7启动子 CMV启动子仙台病毒微小基因组

t7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

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生物化学杂志 1997年第2期13卷 154-158页

作者：周天鸿李月琴王彤歌刘飞鹏暨南大学生物工程系广州510632 暨南大学医学院附属医院

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAt）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的t7噬茵体启动子下游，构建成质粒pt7LDLR和pt7CAt．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAt酶实验显示：两个基因被t7噬菌体启动子所启... 详细信息

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAt）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的t7噬茵体启动子下游，构建成质粒pt7LDLR和pt7CAt．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAt酶实验显示：两个基因被t7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别t7启动子，转录外源基因．常用的含有t7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．

关键词：哺乳动物纲基因表达 t7启动子

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启动子旁侧序列对t7启动子功能的影响

启动子旁侧序列对T7启动子功能的影响

作者：龙丽娟广西医科大学

学位级别：硕士

目的:观察t7启动子5’端不同旁侧序列对t7启动子转录活性的影响。方法:1.以质粒PEt-42a(+)为模板,应用重叠PCR方法扩增质粒中的t7启动子,并在t7启动子的5’-端插入不同的短链重复序列(即4碱基C、5碱基A、G和t),PCR片段两端分别含XbaⅠ、... 详细信息

目的:观察t7启动子5’端不同旁侧序列对t7启动子转录活性的影响。方法:1.以质粒PEt-42a(+)为模板,应用重叠PCR方法扩增质粒中的t7启动子,并在t7启动子的5’-端插入不同的短链重复序列(即4碱基C、5碱基A、G和t),PCR片段两端分别含XbaⅠ、sphⅠ酶切位点。2.用限制性内切酶消化PCR片段和质粒PEt-42a(+),并分别用试剂盒和超滤离心管纯化回收酶切产物。然后用t4 DNA连接酶连接已纯化的PCR及质粒片段,构建t7启动子5’旁侧序列含不同重复序列的重组质粒。3.将构建好的质粒转化克隆宿主DH5α感受态细胞,扩增质粒,测序并保存菌株。4.提取重组质粒,转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞、测序并保存菌株。5.用不同浓度的IPtG诱导含有目的表达质粒的BL21(DE3)菌株,然后用试剂盒提取细菌总RNA和蛋白质。6.分别用qRt-PCR和蛋白质免疫印迹实验(WB)检测GSt-tag mRNA和蛋白的表达水平。7.用SPSS 24.0对实时荧光定量PCR结果进行统计分析。结果:1.测序结果显示,成功构建了t7启动子的5ˊ端连接有正确靶序列的表达质粒PEt-42a(+)。***-tag mRNA的实时荧光定量Rt-PCR结果:在IPtG 1mM条件下诱导1h,含不同质粒BL21(DE3)菌株各组间GSt-tag mRNA水平差异无统计学意义;与阴性对照相比,IPtG诱导的菌株GSt-tag mRNA水平明显增高。***-tag蛋白的WB定量结果:(1)在IPtG 0.11mM-1mM条件下诱导0.5-1h,GSt-tag蛋白水平在各菌株之间差异不显著,与阴性对照相比,IPtG诱导的菌株GSt-tag蛋白水平明显增高。(2)在IPtG 0.028-0.05mM条件下诱导20min,各组间GSt-tag蛋白水平:Po>Pa>Pt>Pc>Pg;与阴性对照相比,IPtG诱导的菌株GSt-tag蛋白水平明显增高。结论:在正常条件下,t7启动子5ˊ端的旁侧序列对t7启动子的转录效率影响不大,但当诱导剂或t7 RNA聚合酶的浓度降低时,则可影响t7启动子的转录效率。该发现提示启动子旁侧序列的改变可能是引起某些个体差异例如疾病易感性等的原因之一。

关键词： t7启动子基因表达调控旁侧序列转录

t7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

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生物工程学报 1997年第4期13卷 362-367页

作者：彭贵洪马忠薛宇鸣陈于红朱德煦南京大学生物化学系南京大学医药生物技术国家重点实验室

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ１１ｄ中，在Ｔ７启动子的作用下，经０１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％，表达产物以无活性的包... 详细信息

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ１１ｄ中，在Ｔ７启动子的作用下，经０１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％，表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性，Ｚｎ２＋选择性沉淀，抗体亲和柱层析，及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附，所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带，其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。

关键词：人尿激酶原高效表达分离纯化 t7启动子

在哺乳类动物细胞中呈现不同表达水平的t7启动子表达系统构建

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生物技术 2000年第5期10卷 1-3页

作者：周天鸿李月琴姚冬生莫雪华暨南大学生命科学技术学院生物工程系广东广州510632

将携带有t7噬菌体RNA聚合酶基因的质粒和neo抗性基因质粒共转化CHO细胞 ,经狭缝RNA和Southernblot杂交实验证实获得表达t7噬菌体RNA聚合酶基因的细胞株。pt7CAt质粒转染未表达和表达的细胞株 ,实验显示两者都能表达报道基因 ,但效率不... 详细信息

将携带有t7噬菌体RNA聚合酶基因的质粒和neo抗性基因质粒共转化CHO细胞 ,经狭缝RNA和Southernblot杂交实验证实获得表达t7噬菌体RNA聚合酶基因的细胞株。pt7CAt质粒转染未表达和表达的细胞株 ,实验显示两者都能表达报道基因 ,但效率不同。实验构建了不同表达水平的t7启动子表达系统。

关键词： t7启动子真核生物表达系统 t7 RNA聚合酶

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真核细胞转录系统启动t7启动子起始的研究

暨南大学学报（自然科学与医学版） 2000年第3期21卷 95-99页

作者：周天鸿李月琴朱嘉明云泓若肖小敏暨南大学生物工程学系广东广州510632 暨南大学医学院第一附属医院妇产科广东广州510630

利用氯霉素乙酰转移酶基因 (CAt)和人低密度脂蛋白受体基因 (LDLR)作为报道基因 ,根据α -鹅膏蕈碱 (α -amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制 ,分析t7噬菌体启动子为哺乳类动物细胞启动外源基因表达的机制结果表明 :真核生物RN... 详细信息

利用氯霉素乙酰转移酶基因 (CAt)和人低密度脂蛋白受体基因 (LDLR)作为报道基因 ,根据α -鹅膏蕈碱 (α -amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制 ,分析t7噬菌体启动子为哺乳类动物细胞启动外源基因表达的机制结果表明 :真核生物RNA聚合酶Ⅱ可启动t7启动子的转录 ;同时应用DNA -蛋白质凝胶泳动技术 ,发现人工合成的t7启动子能与核蛋白质结合。

关键词： t7启动子 RNA聚合酶Ⅱ 真核细胞转录系统

表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化

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中国畜牧兽医 2024年第5期51卷 2091-2100页

作者：郭禹程晶左玉柱范京惠姜海军河北农业大学动物医学院保定071001 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 详细信息

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有t7启动子的pBluescript SK(+)和含有t7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 tCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和t7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。

关键词： C型禽偏肺病毒迷你基因组反向遗传系统 CMV启动子增强绿色荧光蛋白 t7启动子

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