T7启动子介导体外构建Nucleostem in特异性短发夹状干扰RNA

作     者：岳保红 朱晓燕 孙玲 赵小强 陈艳丽 王清霞 刘帅 张钦宪 YUE Bao-hong;ZHU Xiao-yan;SUN Ling;ZHAO Xiao-qiang;CHEN Yan-li;WANG Qing-xia;LIU Shuai;ZHANG Qin-xian

作者机构：郑州大学第一附属医院检验科郑州大学医学检验系河南郑州450052 郑州大学基础医学院组织胚胎学教研室 郑州大学第一附属医院血液科河南郑州450052 

出 版 物：《中国药理学通报》 (Chinese Pharmacological Bulletin)

年 卷 期：2006年第22卷第6期

页      面：731-735页

核心收录：

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

基　　金：河南省重大科技攻关基金资助项目(No0222031300) 河南省医学创新人才工程基金资助项目(No200084) 

主　　题：T7启动子 核干细胞因子 体外构建 DNA模板 短发夹状干扰RNA 

摘      要：目的体外构建合成针对Nuc leostem in(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNA i)为手段的白血病基因治疗可行性。方法从Nuc leostem in基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3′端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5′-UCUCUUGAA-3′作为Loop环。以23个碱基的5-′GGATC-CTAATACGACTCACTATA-3′作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5′端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5′端带有AA,共72个碱基。在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polym erase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果。结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24μmol.L-1和3.35μmol.L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%。结论体外成功构建和合成了两条针对Nu-c leostem in基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变。所合成的shR-NA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具。