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skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究

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Skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的功能研究

作者：王宇峰南京医科大学

学位级别：硕士

为了筛选一些在早期胚胎发育过程中起作用的蛋白,本实验室构建了小鼠卵细胞激活前后的蛋白谱系,通过质谱鉴定、生物信息学分析及相关文献查阅,我们选择了skp1这个蛋白进行了深入的功能研究。前人有研究报道了在酵母中skp1能参与纺锤体ch... 详细信息

为了筛选一些在早期胚胎发育过程中起作用的蛋白,本实验室构建了小鼠卵细胞激活前后的蛋白谱系,通过质谱鉴定、生物信息学分析及相关文献查阅,我们选择了skp1这个蛋白进行了深入的功能研究。前人有研究报道了在酵母中skp1能参与纺锤体checkpoint的激活及信号的传递,此外,它还在许多关键的细胞通路中起重要作用,这些结果提示skp1可能在胚胎早期发育过程中起相当重要的作用。在本研究中,我们首先构建了小鼠激活前后卵细胞的蛋白谱系。从2D胶上我们得到以下信息:skp1在激活前后卵细胞中表达较多,其表达量在激活前后无明显变化;skp1在2D胶上呈不同分子量的上下两排分布,推测其可能是一种糖基化的修饰。随后我们运用westernblot方法进一步验证了skp1存在于小鼠卵细胞及孤雌激活卵细胞中。其表达情况与2D胶上的情况类似,即表达量不随激活而改变,呈不同分子量的上下两行分布,下面一行蛋白的分子量与理论分子量18700Da较接近。免疫组织化学的结果显示skp1主要定位于各级卵母细胞的胞浆中,另外黄体中也有少量分布。免疫荧光的结果与免疫组化的结果类似,skp1主要定位于卵细胞及各级胚胎的胞浆中,并且其表达量及表达定位随胚胎发育不发生改变。为研究skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中发挥的作用,我们首先构建了pEGFP-skp1-C2超表达质粒,通过显微注射的方法将其注射至受精卵原核中然后观察受精卵的发育情况,结果发现相对于对照组胚胎,超表达skp1蛋白的胚胎的发育受到不同程度的阻滞,有较多的胚胎不能正常致密化而发育至囊胚阶段,以上结果提示skp1蛋白超表达能阻滞小鼠早期胚胎的发育。为进一步验证以上实验结果,我们将skp1抗体注射至受精卵中然后观察胚胎的发育情况。结果显示受精卵进行skp1抗体注射后其发育得到了促进,在相同的时间内抗体组胚胎的发育要快于对照组胚胎的发育。这些实验结果证实了skp1蛋白的阻断能促进小鼠早期胚胎的发育,这也与上面超表达实验的结果是一致的。得到以上的实验表型,我们接下来研究skp1影响小鼠早期胚胎发育的机制。前人有研究显示在酵母中,skp1能与纺锤体checkpoint蛋白相互作用从而参与纺锤体checkpoint激活与信号的传递,那么skp1蛋白的阻断就会导致这一监督机制的废除从而使本该被阻止发育的非正常细胞能够继续发育下去。鉴于我们得到的实验表型与此相符,即skp1抗体阻断后胚胎的发育得到促进,因此我们进一步研究这些注射过抗体后的胚胎。首先我们使用免疫荧光的方法观察经过skp1抗体注射处理后的卵细胞和胚胎的纺锤体形态,结果显示卵细胞经过skp1抗体注射处理后其纺锤体形态出现异常的机率大大提高,异常率接近40%,明显高于阴性对照组和空白对照组的10.3%和5.4%。纺锤体的异常包括出现多极纺锤体,纺锤丝散乱不规则,纺锤体形态畸形甚至出现断裂。另外,相对于正常卵细胞染色体规则紧密排列于赤道板,注射skp1抗体后的卵细胞其染色体出现排列松散紊乱的机率也有明显提高。取受精卵进行实验也得到了类似的结果,以上实验数据提示skp1抗体注射后能明显提高卵细胞和受精卵出现纺锤体形态及染色体排列异常的机率。同时我们还进行了染色体核型分析实验,取受精卵进行skp1抗体注射后通过Giemsa染色的方法观察染色体的数目,结果发现注射抗体的实验组胚胎出现非整倍体的机率相对于对照组明显提高,非整倍体率达到46.4%,这说明skp1蛋白的阻断会诱使胚胎出现非整倍体。在体实验把处理过的胚胎移植到假孕母鼠子宫内,发现实验组平均产仔数为3.6个,明显低于正常对照组的7个,仔鼠死亡率也有所上升。通过以上的实验,我们发现skp1蛋白的阻断虽然能促进胚胎的发育,但这些发育得到促进的胚胎出现纺锤体形态染色体排列异常及非整倍体的机率也明显提高,从而导致产仔数降低与新生鼠的死亡。这与前人研究的结果是一致的,因此我们推测在哺乳动物中skp1蛋白可能与纺锤体checkpoint蛋白相互作用从而参与纺锤体checkpoint激活及信号传递。综上,我们研究了skp1蛋白在小鼠卵细胞及胚胎中的定位表达,发现skp1蛋白的超表达能阻滞胚胎的发育,而skp1蛋白的阻断则能促进胚胎的发育,进一步研究发现这些发育促进的胚胎出现纺锤体形态异常及非整倍体的机率明显提高,从而导致胚胎移植后产仔数降低及新生鼠死亡率提高。我们的研究证实了skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中起关键作用,并推测哺乳动物中skp1在激活和维持纺锤体checkpoint通路过程中发挥重要作用。

关键词： skp1 早期胚胎纺锤体checkpoint

小麦雄性不育相关基因skp1的克隆与表达分析

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小麦雄性不育相关基因SKP1的克隆与表达分析

作者：宋瑜龙西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦(Triticum aestivum)是世界上重要的粮食作物,是人类得以生存繁衍的重要物质基础,与其它作物一样,利用杂种优势也是提高其产量和改良品质的最有效方法。然而,小麦杂种优势理论与实践研究还远不如玉米、水稻、油菜等作物那样广泛与... 详细信息

小麦(Triticum aestivum)是世界上重要的粮食作物,是人类得以生存繁衍的重要物质基础,与其它作物一样,利用杂种优势也是提高其产量和改良品质的最有效方法。然而,小麦杂种优势理论与实践研究还远不如玉米、水稻、油菜等作物那样广泛与深入。尤其是小麦雄性不育最佳利用途径与机理研究目前已成为攻克小麦杂种优势利用这一世界性难题的重要突破口。概括国内外小麦不育类型,主流研究可分为两大方面,即生理型雄性不育和遗传型雄性不育。对其研究,不同学者侧重点不同,从育性基因、育性差异蛋白、育性生理生化代谢途径等都进行了系列研究。泛素蛋白酶途径是细胞内冗余蛋白质降解的重要途径,其帮助细胞内冗余蛋白质降解,并能保证细胞内部复杂的生理生化过程正常进行。一类参与泛素蛋白酶途径的小分子量蛋白skp1(S-phase kinase-associated-protein 1)广泛存在于真核生物中。其主要参与SCF复合体的形成,为维护SCF复合体的生物学功能起到了举足轻重的作用。SCF与细胞周期调控有关,其在生物体内主要是调控细胞内泛素介导的蛋白质降解过程,同时参与细胞内发育的多项生理过程。本研究正是基于skp1上述作用,以化学杀雄剂SQ-1作为小麦雄性不育诱导剂,以小麦品种西农2611为试验材料,分喷药和不喷药(对照)两种处理,采集其花药作为实验材料,以前人研究得出的结果,SQ-1诱导的小麦雄性不育大多发生在单核后期至二核期,故以处理和对照花药的二核期cDNA材料为基础,通过NCBI查询拟南芥skp1基因的序列从而设计引物并进行skp1基因全长的扩增,将分别从SQ-1处理的和未处理的二核期材料中扩增得到的序列进行序列同源性比对,同时,进行西农2611花药处于单核期,二核期,三核期各时期skp1基因的荧光定量表达,试图为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定一定理论基础。通过研究,获得如下结果:(1)skp1基因的表达与SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育相关。(2)从西农2611处理的和未处理的二核期cDNA中扩增,五次重复测序,最终得到了一段852bp长度的基因序列,经过比对和判断是属于小麦skp1基因家族中的一份子,从而得到了新的小麦西农2611二核期skp1基因序列,并将其上传至NCBI文库。(3)分别所获得的SQ-1处理的二核期和对照二核期2611的两段全长基因序列利用软件DNAman进行序列比对,结果发现,这两段基因序列的比对结果显示,只有第477个碱基有差异,其余的碱基序列完全保持一致。将此二者基因序列利用PrimerPrimer5.0软件进行翻译表达并比较二者翻译的蛋白质序列,结果得出,一个碱基差异并不能引起蛋白质翻译的差异。由此看出,在经过SQ-1处理的材料和对照材料中,skp1基因的转录并没有受到影响,也就是说,SQ-1处理小麦未能引起基因转录水平的差异。(4)利用荧光定量PCR技术对skp1基因在生理型不育株和可育株花药中表达进行了定量分析。结果表明,该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)表达量均表现为下降趋势,并且该基因在不育株花药发育的三个时期表达均相对于可育株被明显抑制。推测该基因在花粉粒发育过程中下调表达可能影响了小麦花粉粒发育过程中蛋白质泛素降解途径而导致雄性不育。

关键词：小麦杀雄剂SQ-1 skp1 SCF 荧光定量PCR

第一部分：skp1蛋白在非小细胞肺癌组织和外周血中的表达水平及其临床意义第二部分：SUMO激活酶E1亚基（SAE1）在肺癌发生与发展中的生物学功能研究

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第一部分：Skp1蛋白在非小细胞肺癌组织和外周血中的表达水平及其...

作者：朱嘉微北京协和医学院

学位级别：硕士

第一部分:skp1蛋白在非小细胞肺癌组织和外周血中的表达水平及其临床意义背景与目的S期激酶相关蛋白1(skp1)是SCF泛素连接酶复合物的一种特异性连接蛋白,它可以通过稳定F-box蛋白,从而增强底物结合能力,参与到细胞周期调控中,与肿瘤的... 详细信息

第一部分:skp1蛋白在非小细胞肺癌组织和外周血中的表达水平及其临床意义背景与目的S期激酶相关蛋白1(skp1)是SCF泛素连接酶复合物的一种特异性连接蛋白,它可以通过稳定F-box蛋白,从而增强底物结合能力,参与到细胞周期调控中,与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究证明SCF复合物在肿瘤的发生中起着关键作用,并且一些F-box蛋白已被证明是治疗人类癌症的潜在靶点。然而,关于skp1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的研究还比较少,其是否可以作为NSCLC治疗靶点仍有待进一步研究。本研究通过检测skp1在非小细胞肺癌组织和外周血中的蛋白表达水平并探讨其临床意义,为临床评估提供一定的理论依据。方法采用Western blot方法检测34例NSCLC组织及相应癌旁组织中skp1蛋白的表达水平。采用组织芯片和免疫组织化学染色的方法检测skp1在86例NSCLC组织及相应癌旁组织中的表达情况,并分析skp1蛋白的表达与NSCLC临床病理参数及患者预后的关系。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测39例NSCLC患者及27例健康人血浆中skp1蛋白水平,并分析NSCLC及正常健康人血浆中skp1蛋白水平差异和skp1的水平与NSCLC临床参数的关系。结果Western blot和免疫组织化学染色结果显示,skp1蛋白在NSCLC组织中的表达水平均显著高于其在相应癌旁组织中的表达水平(P1)。ELISA结果显示,NSCLC病人血浆中的skp1蛋白水平显著高于健康人群(P=0.003)。Kaplan-Meier单因素生存分析显示,skp1蛋白在NSCLC组织中的高表达与中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者的不良预后显著相关(P=0.001),多因素Cox回归分析显示,skp1蛋白能够作为影响中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者预后的独立危险因素。skp1蛋白表达水平与NSCLC患者的性别、年龄、病理类型、淋巴结转移等因素无显著相关关系(P>0.05)。结论skp1蛋白在NSCLC患者中高表达,并且skp1蛋白在NSCLC组织中高表达与中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者的不良预后显著相关,可作为中晚期NSCLC患者预后的独立危险因素。第二部分:SUMO激活酶E1亚基(SAE1)在肺癌发生与发展中的生物学功能研究背景与目的SUMO化途径是一种重要的翻译后修饰途径,SUMO蛋白家族介导的转录后修饰通过调节多种细胞过程,包括转录、复制、染色体分离和DNA修复,从而驱动肿瘤发生的不同阶段。SUMO激活酶E1亚基(SAE1)是SUMO化途径中的第一个酶,其在Myc介导的肿瘤发生中扮演着重要角色,然而目前关于SAE1在肺癌的研究较少,功能尚未明确。实验室前期利用质谱技术比较了肺癌和COPD患者痰液中气道脱落细胞蛋白质差异表达情况,分析鉴定出SAE1在肺癌患者痰细胞中显著高表达。免疫组织化学结果显示SAE1蛋白在非小细胞肺癌组织中过表达,并与非小细胞肺癌的病理类型及肺鳞癌患者总生存期相关,提示SAE1可能在肺癌发生发展中起重要作用。本课题旨在通过改变肺癌细胞内SAE1的表达水平,检测其对肺癌细胞恶性表型的影响,进一步探索SAE1在肺癌发生发展中所发挥的生物学功能,为其在临床应用提供理论依据。方法首先,利用shRNA技术和质粒克隆技术在肺癌细胞系中敲降和过表达细胞内源性SAE1基因,构建SAE1敲降和过表达质粒,瞬时和稳定转染肺癌细胞系。通过Western blot检测SAE1在肺癌细胞系的表达改变水平,并检测Myc基因相应的表达变化。利用CCK-8实验和transwell实验检测SAE1基因表达变化对肺癌细胞增殖和迁移能力的影响。最后,利用裸鼠致瘤实验比较各组裸鼠成瘤能力的差异,进而评估SAE1基因对细胞恶性程度的影响。结果Western blot从蛋白水平上证实了肺癌细胞系中SAE1基因的敲降和过表达效果,并且Myc基因也出现了相应的改变。CCK-8实验表明,SAE1基因敲降后显著抑制A549细胞和H1299细胞的增殖,P1;SAE1基因过表达后显著促进H1299细胞和H520细胞的增殖,P1。Transwell结果显示,SAE1基因表达下调导致H1299细胞和H520细胞的迁移能力受到明显抑制,P1。H1299细胞裸鼠成瘤实验中,与对照组相比,SAE1敲降组小鼠成瘤能力明显减弱,对细胞恶性程度降低,P1。结论我们的研究结果进一步证实了Myc的致癌活性依赖于SAE1,并且SAE1基因表达上调后,肺癌细胞的增殖能力加强;SAE1基因表达下调后,肺癌细胞的增殖、迁移和成瘤能力都受到抑制。

关键词： skp1 非小细胞肺癌预后危险因素 SUMO化 SAE1 增殖和迁移

skp1蛋白在非小细胞肺癌组织和外周血中的表达水平及其临床意义

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癌变．畸变．突变 2019年第2期31卷 89-95页

作者：朱嘉微胡箫王希君王雅茹冯林肖汀国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室癌发生及预防分子机理北京市重点实验室北京100021

目的:检测S期激酶相关蛋白1(skp1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和外周血中的表达水平并探讨其临床意义。方法:采用Western blot检测34例NSCLC组织及相应癌旁组织中skp1蛋白的表达水平。采用组织芯片和免疫组织化学染色检测skp1在86例NSCL... 详细信息

目的:检测S期激酶相关蛋白1(skp1)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和外周血中的表达水平并探讨其临床意义。方法:采用Western blot检测34例NSCLC组织及相应癌旁组织中skp1蛋白的表达水平。采用组织芯片和免疫组织化学染色检测skp1在86例NSCLC组织及相应癌旁组织中的表达情况,并分析skp1蛋白的表达与NSCLC临床病理指标及患者预后的关系。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测39例NSCLC患者及27例健康人血浆中的skp1蛋白水平。结果:Western blot和免疫组化法分析结果显示skp1蛋白在NSCLC组织中的表达水平均显著高于相应癌旁组织(P1)。ELISA法分析结果显示NSCLC病人血浆中的skp1蛋白表达水平显著高于健康人群(P=0.003)。Kaplan-Meier单因素生存分析显示skp1蛋白在NSCLC组织中的高表达与中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者的不良预后显著相关(P=0.001),多因素Cox回归分析显示skp1蛋白能够作为影响中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者预后的独立危险因素。skp1蛋白表达水平与病理类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移等因素无显著相关关系(P>0.05)。结论:skp1蛋白在NSCLC患者中高表达,并且skp1蛋白在NSCLC组织中的高表达与中晚期(Ⅱ+Ⅲ)NSCLC患者的不良预后显著相关,可作为中晚期NSCLC患者预后的独立危险因素。

关键词： skp1 非小细胞肺癌预后危险因素

Gmskp1,a Novel S-phase Kinase-associated Protein 1 in Glycine max,Enhancing Resistance Against Phytophthora sojae Infection

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Journal of Northeast Agricultural University(English Edition) 2023年第1期30卷 1-12页

作者： Ning Bin Li Wei-wei Liu Xin Ji Wei Wang Yu-hong Zhao Ming He Sheng-fu Zhang Chuan-zhong Rong Tian-yu Liu Dong-xue Xu Peng-fei Zhang Shu-zhen Soybean Research Institute of Northeast Agricultural University Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Education MinistryHarbin 150030China Keshan Branch Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Keshan 161600HeilongjiangChina

Phytophthora root and stem rot of soybean caused by Phytophthora sojae(***)is a devastating disease that affects soybean[Glycine max(L.)Merr.]all over the world.S-phase kinase-associated protein 1(skp1)proteins are key members of the skp1/Cullin/F-box protein(SCF)ubiquitin ligase complex and play diverse roles in plant ***,the role of skp1 in soybean against the phytopathogenic oomycete *** remains *** this study,a novel member of the soybean skp1 gene family,Gmskp1 which was significantly induced by ***,was *** expression of Gmskp1 was simultaneously induced by methyl jasmonate(MeJA),salicylic acid(SA)and ethylene(ET),which might suggest an important role for Gmskp1 of plant in responses to hormone *** analysis using Gmskp1 overexpression lines showed that Gmskp1 enhanced resistance to *** in transgenic soybean *** analyses showed that Gmskp1 interacted with a homeodomain-leucine zipper protein transcription factor(GmHDL56)and a WRKY transcription factor(GmWRKY31),which could positively regulate responses to *** in ***,several pathogenesis-related(PR)genes were constitutively activated,including GmPR1a,GmPR2,GmPR3,GmPR4,GmPR5a and GmPR10,in Gmskp1-OE soybean *** together,these results suggested that Gmskp1 enhanced resistance to *** in soybean,possibly by activating the defense-related PR genes.

关键词： Phytophthora sojae soybean skp1 overexpression pathogenesis-related gene

F-box like motif of CCYV P22 is crucial for silencing suppressor activity by interacting with Csskp1LB1

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F-box like motif of CCYV P22 is crucial for silencing suppre...

大豆疫霉有丝分裂S期激酶蛋白相关基因Psskp1克隆与功能分析

中国植物病理学会第十一届全国会员代表大会暨2018年学术年会

作者： Wei Yin Han Xiaoyu Chen Siyu Shi Yan College of Plant Protection Henan Agricultural University

Plants employ RNA silencing as a virus defense *** response,viruses encode various RNA silencing suppressors to counteract the antiviral ***,we identify P22 as a silencing suppressor of CCYV and show that P22 interacts with Cucurmis sativus orthologs of S-phase kinase related protein 1(skp1) via its F-box like *** F-box like motif deletion mutant of P22 abolished P22 pathogenicity and silencing suppressor *** analysis of Nicotiana benthamiana leaves expressing P22 and its F-box like motif deletion mutant further confirmed indispensibilty of F-box like motif for the ubiquitin mediated proteolysis and methionine metabolism.S-adenosyl--methionine synthase(SAMS),a key enzyme for HEN1 activity,was undetectable in P22 expressing leaves while expressed in its deletion *** together,our results suggest that P22 acts as silencing suppressor possibly via depriving HEN1 of its substrate S-adenosyl--methionine(SAM) through the ubiquitin mediated proteolysis.

关键词： Cucurbit chlorotic yellows virus Silencing suppressor Ubiquitin skp1 F-box Proteomic analysis

来源： cnki会议评论

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大豆疫霉有丝分裂S期激酶蛋白相关基因PsSkp1克隆与功能分析

作者：刘栓林安徽农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的土传病害,由Phytophthora sojae引起。该菌寄主范围窄,只侵染大豆。细胞有丝分裂S期激酶相关蛋白skp1是泛素连接酶家族SCF复合物(skp1-Cul1-F-box蛋白)的一个成员,大豆疫霉主要是通过菌丝体和游动孢子进行... 详细信息

大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的土传病害,由Phytophthora sojae引起。该菌寄主范围窄,只侵染大豆。细胞有丝分裂S期激酶相关蛋白skp1是泛素连接酶家族SCF复合物(skp1-Cul1-F-box蛋白)的一个成员,大豆疫霉主要是通过菌丝体和游动孢子进行病害的传播,如果能够破坏菌丝体的生长和游动孢子的产生,就可以有效的防治病害。本文研究的细胞有丝分裂S期激酶相关蛋白skp1白能够影响生物体内蛋白质的分泌,调节细胞的生理周期,并参与生物发育过程。本验通过RAN干扰技术,构建了Phytophthora sojae skp1基因的沉默表达载体pTOR-skp1-GFP。利用原生质体介导转化方法,将沉默载体导入野生型大豆疫霉6497中,从而使目的基因得到瞬时表达,实验获得了该基因的沉默突变菌株。通过qRT-PCR实验,选择出突变菌株中skp1基因表达量比较低的两个菌株,命名为L1、L2进行实验。通过胁迫、菌丝侵染、游动孢子诱导和致病性测定、电镜观察试验,对沉默突变体进行表型分析。通过对沉默突变菌株进行生长速率测定试验,发现沉默突变体的生长速度较为缓慢;把突变体在胁迫培养基上培养,分析得出其抗氧化能力和耐盐性均有所减弱;诱导菌株游动孢子囊及游动孢子,发现产生沉默突变体游动孢子囊数量减少,为原始菌株的20%-30%;通过对致病性研究发现沉默突变体的菌丝生长畸形,分枝较多,顶端较粗,提前衰老死亡,对寄主大豆侵染能力和致病性均下降;游动孢子对大豆黄花苗侵染能力和致病性均下降。

关键词：大豆疫霉 RNAi skp1 沉默转化子表型分析

转化生长因子β1/Smads信号传导通路在哺乳动物卵巢发育中的调控作用及其作用机制

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动物营养学报 2017年第7期29卷 2283-2288页

作者：周敏冯强黄丽波杨在宾杨维仁姜淑贞山东农业大学动物科技学院山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室泰安271018 泰安市中心医院泰安271000

不同信号转导通路间的彼此协调保证了机体的正常运行。在众多的信号通路中,转化生长因子(TGF)β1/Smads信号传导通路越来越受到学者们的关注,已经成为分子生物学和细胞生物学研究的一大热点。已有研究证实,TGF-β1/Smads信号传导通路是... 详细信息

不同信号转导通路间的彼此协调保证了机体的正常运行。在众多的信号通路中,转化生长因子(TGF)β1/Smads信号传导通路越来越受到学者们的关注,已经成为分子生物学和细胞生物学研究的一大热点。已有研究证实,TGF-β1/Smads信号传导通路是调控卵泡发育的重要途径。本文就TGF-β1/Smads信号传导通路与哺乳动物卵巢卵泡的发育进行综述,分别从TGF-β受体、Smads蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)、血小板反应蛋白1(THB-S1)、S期激酶相关蛋白1(skp1)和其他调节机制阐述TGF-β1/Smads信号传导通路在哺乳动物卵巢发育中的调控作用及其机制,旨在引起人们对TGF-β1/Smads调控卵巢发育的关注,并为卵巢发育过程中某些疾病的治疗提供一些参考。

关键词： TGF-β1/Smads 哺乳动物卵巢 BMP THB-S1 skp1

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16互作蛋白的筛选及功能初探

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小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16互作蛋白的筛选及功能初探

作者：杨彦君西北农林科技大学

学位级别：硕士

植原体(phytoplasma)是一种形态不规则且无细胞壁的单细胞原核生物,据统计,全世界由植原体引发的植物病害多达800多种,我国有100余种。我国对植原体病害的报道早在明末《沈氏农书》中就有桑萎缩“凡桑一癃,再无医法,断不可留者”的记载... 详细信息

植原体(phytoplasma)是一种形态不规则且无细胞壁的单细胞原核生物,据统计,全世界由植原体引发的植物病害多达800多种,我国有100余种。我国对植原体病害的报道早在明末《沈氏农书》中就有桑萎缩“凡桑一癃,再无医法,断不可留者”的记载,其对经济林木以及农作物造成严重的经济损失。其中,小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)是我国首次报道的小麦植原体病害,可引起植株矮化、丛枝增多、叶尖发黄等症状,感病植株大多因不能正常抽穗而不结实,导致西北干旱麦区减产,发病较重的麦区产量损失可达到60%～80%,甚至绝收。因此,对小麦蓝矮植原体致病机制、植原体与寄主互作关系及其防控技术的研究至关重要。本实验室前期测序完成了小麦蓝矮植原体基因组图谱,并通过RNA沉默抑制子鉴定系统对预测到的37个分泌蛋白进行鉴定,发现效应蛋白SWP16具备抑制系统性RNA沉默的功能,并且显著促进PVX侵染,因此初步确定其为一个具有活性的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor)。目前,国内外对植原体RNA沉默抑制子的鉴定及其与寄主的互作蛋白均无相关研究报道,因此本实验以寻找沉默抑制子SWP16的互作蛋白为切入点,通过酵母双杂交方法筛得候选蛋白并结合酵母一对一验证、Bi FC、共定位(免疫荧光)及荧光强度分析实验确定互作,进而通过VIGS及过表达技术找到关键互作蛋白,揭示WBD植原体沉默抑制子的作用机制,取得的主要研究结果如下:(1)互作蛋白的筛选与生物信息学分析。利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以p BT3STE-SWP16为诱饵,从小麦文库中共获得22种互作蛋白,复筛验证和α-半乳糖苷酶检测结果显示,22种候选蛋白全部与SWP16互作。对候选蛋白进行GO注释分析后结合转录组测序结果,初步选择细胞色素B561、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基PW9、小麦水通道蛋白TIP2、S期激酶相关蛋白1(skp1)等4种可能与沉默通路相关的靶标蛋白,进一步验证互作。(2)利用酵母双杂交(Y2H)、Bi FC及共定位(免疫荧光)实验确定了4种候选蛋白与沉默抑制子SWP16的互作关系。克隆4种候选蛋白的CDS序列进行酵母双杂交实验,结果表明4种候选蛋白均与沉默抑制子SWP16存在相互作用,双分子荧光互补(Bi FC)实验表明,SWP16与4种候选蛋白主要在膜上互作,共定位(免疫荧光)实验进一步验证了互作结果。其中skp1作为SCF(skp1-Cul1-F-box)泛素连接酶复合体的接头蛋白可能在沉默通路中发挥重要影响,因此通过荧光强度分析实验进一步确定了SWP16促进skp1基因的表达。(3)利用VIGS及基因过表达(overexpression)技术探究skp1对SWP16功能的影响。构建病毒诱导的基因沉默载体TRV2-Nb skp1,在沉默Nb skp1基因后,过表达PBI121-GFP和PBI121-SWP16,25天后在紫外灯下观察本氏烟16c表型,结果表明此时SWP16不再发挥系统性沉默抑制子功能,并通过RT-q PCR及蛋白定量的方法检测GFP的相对表达量,检测结果与表型结果一致,表明skp1在SWP16发挥系统性沉默抑制子功能的过程中起关键作用。综上所述,本实验通过酵母双杂交筛库共获得22种互作蛋白,其中4种可能与系统性沉默相关,经分析鉴定得出,skp1是小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16发挥功能的关键互作蛋白,对Nb skp1基因的沉默可直接导致SWP16沉默抑制子功能的丧失,推测SWP16需要借助skp1来逃避植物的识别及降解以维持自身稳定,或是间接影响其他通路来抑制沉默复合体的形成。本研究为首次筛选植原体RNA沉默抑制子的互作蛋白,有助于进一步解析小麦蓝矮植原体的致病机理并探索出植原体病害防控新技术。

关键词：小麦蓝矮植原体 RNA沉默抑制子分离泛素酵母双杂交 skp1