小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16互作蛋白的筛选及功能初探

作     者：杨彦君 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴云锋

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：小麦蓝矮植原体 RNA沉默抑制子 分离泛素酵母双杂交 SKP1 

摘      要：植原体(phytoplasma)是一种形态不规则且无细胞壁的单细胞原核生物,据统计,全世界由植原体引发的植物病害多达800多种,我国有100余种。我国对植原体病害的报道早在明末《沈氏农书》中就有桑萎缩“凡桑一癃,再无医法,断不可留者的记载,其对经济林木以及农作物造成严重的经济损失。其中,小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)是我国首次报道的小麦植原体病害,可引起植株矮化、丛枝增多、叶尖发黄等症状,感病植株大多因不能正常抽穗而不结实,导致西北干旱麦区减产,发病较重的麦区产量损失可达到60%～80%,甚至绝收。因此,对小麦蓝矮植原体致病机制、植原体与寄主互作关系及其防控技术的研究至关重要。本实验室前期测序完成了小麦蓝矮植原体基因组图谱,并通过RNA沉默抑制子鉴定系统对预测到的37个分泌蛋白进行鉴定,发现效应蛋白SWP16具备抑制系统性RNA沉默的功能,并且显著促进PVX侵染,因此初步确定其为一个具有活性的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor)。目前,国内外对植原体RNA沉默抑制子的鉴定及其与寄主的互作蛋白均无相关研究报道,因此本实验以寻找沉默抑制子SWP16的互作蛋白为切入点,通过酵母双杂交方法筛得候选蛋白并结合酵母一对一验证、Bi FC、共定位(免疫荧光)及荧光强度分析实验确定互作,进而通过VIGS及过表达技术找到关键互作蛋白,揭示WBD植原体沉默抑制子的作用机制,取得的主要研究结果如下:(1)互作蛋白的筛选与生物信息学分析。利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以p BT3STE-SWP16为诱饵,从小麦文库中共获得22种互作蛋白,复筛验证和α-半乳糖苷酶检测结果显示,22种候选蛋白全部与SWP16互作。对候选蛋白进行GO注释分析后结合转录组测序结果,初步选择细胞色素B561、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基PW9、小麦水通道蛋白TIP2、S期激酶相关蛋白1(SKP1)等4种可能与沉默通路相关的靶标蛋白,进一步验证互作。(2)利用酵母双杂交(Y2H)、Bi FC及共定位(免疫荧光)实验确定了4种候选蛋白与沉默抑制子SWP16的互作关系。克隆4种候选蛋白的CDS序列进行酵母双杂交实验,结果表明4种候选蛋白均与沉默抑制子SWP16存在相互作用,双分子荧光互补(Bi FC)实验表明,SWP16与4种候选蛋白主要在膜上互作,共定位(免疫荧光)实验进一步验证了互作结果。其中SKP1作为SCF(Skp1-Cul1-F-box)泛素连接酶复合体的接头蛋白可能在沉默通路中发挥重要影响,因此通过荧光强度分析实验进一步确定了SWP16促进SKP1基因的表达。(3)利用VIGS及基因过表达(overexpression)技术探究SKP1对SWP16功能的影响。构建病毒诱导的基因沉默载体TRV2-Nb SKP1,在沉默Nb SKP1基因后,过表达PBI121-GFP和PBI121-SWP16,25天后在紫外灯下观察本氏烟16c表型,结果表明此时SWP16不再发挥系统性沉默抑制子功能,并通过RT-q PCR及蛋白定量的方法检测GFP的相对表达量,检测结果与表型结果一致,表明SKP1在SWP16发挥系统性沉默抑制子功能的过程中起关键作用。综上所述,本实验通过酵母双杂交筛库共获得22种互作蛋白,其中4种可能与系统性沉默相关,经分析鉴定得出,SKP1是小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16发挥功能的关键互作蛋白,对Nb SKP1基因的沉默可直接导致SWP16沉默抑制子功能的丧失,推测SWP16需要借助SKP1来逃避植物的识别及降解以维持自身稳定,或是间接影响其他通路来抑制沉默复合体的形成。本研究为首次筛选植原体RNA沉默抑制子的互作蛋白,有助于进一步解析小麦蓝矮植原体的致病机理并探索出植原体病害防控新技术。