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荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010年第3期28卷 194-199页

作者：张少雷王何兰刘江倪芳徐世三罗大民厦门大学生命科学学院厦门361005 深圳市福田人民医院体检科深圳518033

目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增IT... 详细信息

目的运用荧光定量PCR法检测异尖线虫类病原体。方法于鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫:抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫、内弯对盲囊线虫、带鱼针蛔线虫、灰海鳗对盲囊线虫和台湾海峡鱼类中一优势种对盲囊线虫。提取各虫体DNA,PCR扩增ITS-2序列,测序并进行数据库比对。依据测序结果设计特异引物,常规PCR检验引物特异性。将ITS-2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数均在0.998以上。重复性实验中,6种虫体对应的变异系数(cv)最小值为0.18%,最大值为2.80%,试验间平均cv最小值为0.55%,最大值为1.94%,无非特异性扩增,溶解曲线的特异性和重复性良好。灵敏度实验中,可检出的最低模板浓度为1×102拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍。结论初步建立了sybrgreenⅰ荧光定量PCR检测异尖线虫类病原体的方法。

关键词：异尖线虫病异尖线虫 ITS-2序列荧光定量PCR sybrgreenⅰ

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中国兽医科学 2011年第11期41卷 1176-1181页

作者：马德星高铭扬马春丽宋春林东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 东北农业大学食品学院黑龙江哈尔滨150030

为建立鸡Toll样受体2(ChTLR2)信号通路中相关分子的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中TLR2信号通路中的5种相关分子即ChTLR2-1,ChTLR2-2,ChTLR6,鸡骨髓分化蛋白88(ChMyD88)及鸡核因子κB(ChNF-κB)基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为参考基因,设计特异引物扩增目的基因片段。将6种基因克隆至pMD8-T载体后得到各自的阳性克隆质粒,以6种阳性质粒为标准品建立了标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验分析。应用建立的方法对堆形艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA/Ea3-1E免疫SPF雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA的转录水平进行检测。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010copies/μL时,6种基因Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.995。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。免疫雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA转录水平的检测结果表明,免疫组2种分子mRNA转录水平均极显著高于空白对照组(P<0.01)。本研究为ChTLR信号通路中相关分子的定量分析提供了技术平台。

关键词：鸡 TLR2信号通路 sybrgreenⅰ 实时荧光定量RT-PCR

边缘无浆体SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2011年第3期41卷 262-266页

作者：何德肆徐平源陈文承李芬胡涛彭运潮刘毅湖南生物机电职业技术学院湖南长沙410128 湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

根据GenBank中边缘无浆体的MSP4基因序列(EU677383)设计2对引物(AmspF3/R3和Am-spF4/R4)并克隆MSP4部分基因,构建含有MSP4基因的标准质粒,以AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了边缘无浆体的MSP4SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法... 详细信息

根据GenBank中边缘无浆体的MSP4基因序列(EU677383)设计2对引物(AmspF3/R3和Am-spF4/R4)并克隆MSP4部分基因,构建含有MSP4基因的标准质粒,以AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了边缘无浆体的MSP4SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用于临床血样检测。结果显示,该方法可以检测到1×102 copies/μL的标准质粒DNA,该方法对绵羊无浆体、附红细胞体、东方巴贝斯虫、组织滴虫提取的DNA均为阴性反应。结果表明,该方法与常规PCR方法比较,阳性及阴性符合率都为100%,且具有敏感、重复性好、无污染特性,并具有能准确定量的特点,说明该方法具有很好的应用前景和研究价值。

关键词：边缘无浆体 MSP4基因 sybrgreenⅰ 标准曲线

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双荧光标记定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸

武汉大学学报（医学版） 2007年第4期28卷 529-531页

作者：黎炜英赵友云高应林王春香乐惠荣武汉大学期刊社湖北武汉430072 湖北省中医院检验科湖北武汉430061

目的:探索SYBR GreenⅠ和TaqMan探针双标记荧光定量PCR(dFQ-PCR)检测乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的意义。方法:选择浓度为1011.70,108.70,106.70和0.05);与sybrgreenⅰ染料sFQ-PCR的1011.41±0.35,108.21±0.34和106.26±0.26copies/L(不含未检出的两次血清)比较,中低浓度有统计学意义(t=2.90和2.62,P<0.05)。dFQ-PCR和SYBR GreenⅠ染料sFQ-PCR均出现明显熔解曲线,HBV-DNA含量为1011.70,108.70和106.70copies/L的Tm分别为79.8,71.8和72℃。结论:dFQ-PCR能同时检测HBV-DNA含量和Tm,为HBV含量及其基因分型的同步检测提供了新思路。

关键词： sybrgreenⅰ TaqMan探针定量PCR HBV-DNA

山羊痘病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2012年第7期33卷 32-39页

作者：姚俊杨永军彭海生陈官国段国军鲁富有李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 云南省丽江市华坪县畜牧兽医站云南华坪674800 云南省普洱市动物疫病预防控制中心云南普洱665000

为了建立一种灵敏、特异、快速的山羊痘病毒实时定量检测方法,根据山羊痘病毒(AY077835)gp006基因序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计合成一对PCR引物。将被检测的目的 DNA片段克隆PEASY-T1质粒,制备重组质粒标准品,以期建立以质粒... 详细信息

为了建立一种灵敏、特异、快速的山羊痘病毒实时定量检测方法,根据山羊痘病毒(AY077835)gp006基因序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计合成一对PCR引物。将被检测的目的 DNA片段克隆PEASY-T1质粒,制备重组质粒标准品,以期建立以质粒拷贝数为单位的标准曲线。通过反应条件的优化及引物浓度的筛选,建立了山羊痘病毒SYBR GreenⅠ实时定量PCR(real-time PCR)检测方法,最佳引物浓度为400nmol/L。组内重复试验和组间重复试验变异系数均低于2%,最低检测限为1×101 copies/μL,上机检测时间在1h以内。用该方法对2011年流行于云南华坪、景谷及2003年流行于云南宣威、寻甸和昆明的山羊痘临床组织样品进行定量检测,结果送检组织样品抽提DNA中病毒含量分别为1.03×105、5.30×103、1.51×104、4.74×103、7.20×104 copies/μL。结果表明,所建立的real-time PCR具有灵敏、特异、快速的特点,适合于山羊痘临床组织样品的定量检测。

关键词：山羊痘病毒 sybrgreenⅰ 实时定量PCR

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2019年第7期49卷 834-840页

作者：辛佳亮汪伟杜倩韩知晓闭璟珊曹亮孙文超方志超郑敏广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西南宁530000 温州大学病毒学研究所浙江温州325035 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130122 广西扬翔股份有限公司广西贵港537100

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基... 详细信息

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoVM基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10^8~6.57×10^1copies/L范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10^1copies/L;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。

关键词：猪德尔塔病毒 sybrgreenⅰ 荧光定量PCR

SYBR GreenⅠ模式荧光RT-PCR检测新城疫病毒

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农业生物技术学报 2005年第6期13卷 783-786页

作者：弋英陈继明王志亮孙承英鲍恩东农业部动物检疫所南京农业大学动物医学院

针对新城疫病毒(NDV)F基因保守区内的核苷酸序列设计1对引物,以此对引物和标准NDV毒株(含NDV强毒和弱毒)的RNA为模板,建立并优化sybrgreenⅰ模式荧光RT-PCRNDV检测方法。如果待测样品扩增产物的Tm值和阳性对照的Tm值相差在2℃范围之内... 详细信息

针对新城疫病毒(NDV)F基因保守区内的核苷酸序列设计1对引物,以此对引物和标准NDV毒株(含NDV强毒和弱毒)的RNA为模板,建立并优化sybrgreenⅰ模式荧光RT-PCRNDV检测方法。如果待测样品扩增产物的Tm值和阳性对照的Tm值相差在2℃范围之内判为阳性。此法比文献报道的普通RT-PCR法更敏感,但仍低于鸡胚接种分离病毒法。

关键词：新城疫病毒荧光RT-PCR sybrgreenⅰ

实时荧光定量PCR方法检测大肠杆菌O157:H7

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农业生物技术学报 2006年第5期14卷 779-782页

作者：陈思黄昆仑许文涛李媛罗云波中国农业大学食品学院北京100083 中国农业大学食品学院

针对大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7的致病基因eae设计了特异性引物,并用荧光染料sybrgreenⅰ进行了实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。并对反应程序进行了优化,确定了... 详细信息

针对大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7的致病基因eae设计了特异性引物,并用荧光染料sybrgreenⅰ进行了实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。并对反应程序进行了优化,确定了最佳的反应程序,最终在合适的模板浓度内得出了标准曲线。结果显示Real-timePCR比普通PCR灵敏1000倍。

关键词：大肠杆菌O157:H7 sybrgreenⅰ 实时荧光定量 real-timePCR

泡球蚴感染小鼠IL-17基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立与检测

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中国病原生物学杂志 2011年第1期6卷 35-38页

作者：张志王俊华张传山吕国栋卢晓梅姜涛林仁勇温浩新疆医科大学第一附属医院新疆包虫病基础医学重点实验室新疆乌鲁木齐830054 新疆医科大学第一附属医院消化血管外科中心

目的建立检测泡球蚴感染小鼠IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。方法通过腹腔注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,感染1个月后处死,提取肝脏总RNA,反转录得到cDNA;登陆GenBank,得到IL-17... 详细信息

目的建立检测泡球蚴感染小鼠IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。方法通过腹腔注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,感染1个月后处死,提取肝脏总RNA,反转录得到cDNA;登陆GenBank,得到IL-17基因（U43088.1）全序列,选取保守序列,应用pri mer 5设计引物,β-actin作为内参,以10倍梯度稀释IL-17 PCR产物为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR以确定方法的特异性和灵敏度;绘制标准曲线,确定IL-17基因检测的最佳条件。结果用建立的实时定量RT-PCR检测IL-17基因无非特异性扩增,各样品熔解温度均在81.0℃,熔解峰单一;mRNA检出限为1×102pg,106~102pg总RNA均有扩增;泡球蚴感染1个月后,IL-17基因表达显著增加,感染组和对照组分别为（0.008728±0.000984）和（0.003823±0.00082）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功建立了小鼠源IL-17基因实时定量RT-PCR检测体系。经检测,小鼠感染泡球蚴1个月后IL-17基因表达增加,表明IL-17在泡球蚴感染免疫调节中可能起重要作用。

关键词：泡球蚴实时荧光定量RT-PCR IL-17 sybrgreenⅰ