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The short form of the SUR1 and its functional implications in the damaged brain

Neural Regeneration Research 2022年第3期17卷 488-496页

作者： Iván Alquisiras-Burgos Javier Franco-Pérez Moisés Rubio-Osornio Penélope Aguilera Laboratorio de Patología Vascular Cerebral Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía“Manuel Velasco Suárez”CDMXMexico Laboratorio de Formación Reticular Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía“Manuel Velasco Suárez”CDMXMexico Laboratorio Experimental de Enfermedades Neurodegenerativas Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía“Manuel Velasco Suárez”CDMXMexico.

Sulfonylurea receptor(sur) belongs to the adenosine 5′-triphosphate(ATP)-binding cassette(ABC) transporter family;however,sur is associated with ion channels and acts as a regulatory subunit determining the opening or closing of the pore.Abcc8 and Abcc9 genes code for the proteins SUR1 and sur2,respectively.The SUR1 transcript encodes a protein of 1582 amino acids with a mass around 140–177 k Da expressed in the pancreas,brain,heart,and other tissues.It is well known that SUR1 assembles with Kir6.2 and TRPM4 to establish K_(ATP) channels and non-selective cation channels,respectively.Abbc8 and 9 are alternatively spliced,and the resulting transcripts encode different isoforms of SUR1 and sur2,which have been detected by different experimental strategies.Interestingly,the use of binding assays to sulfonylureas and Western blotting has allowed the detection of shorter forms of sur(-65 k Da).Identity of the SUR1 variants has not been clarified,and some authors have suggested that the shorter forms are unspecific.However,immunoprecipitation assays have shown that sur2 short forms are part of a functional channel even coexisting with the typical forms of the receptor in the heart.This evidence confirms that the structure of the short forms of the surs is fully functional and does not lose the ability to interact with the channels.Since structural changes in short forms of sur modify its affinity to ATP,regulation of its expression might represent an advantage in pathologies where ATP concentrations decrease and a therapeutic target to induce neuroprotection.Remarkably,the expression of SUR1 variants might be induced by conditions associated to the decrease of energetic substrates in the brain(e.***.during stroke and epilepsy).In this review,we want to contribute to the knowledge of SUR1 complexity by analyzing evidence that shows the existence of short SUR1 variants and its possible implications in brain function.

关键词： brain edema epilepsy Parkinson's disease stroke sulfonylurea receptor 1 SUR1 traumatic brain injury TRPM4

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SUR1、TRPM4和AQP4在人创伤性脑损伤中的时空表达及其组织浓度与患者预后相关性研究

SUR1、TRPM4和AQP4在人创伤性脑损伤中的时空表达及其组织浓度与...

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作者：李宁海南医学院

学位级别：硕士

目的:创伤性脑损伤(TBI)指脑部遭受外力损伤后引起一系列病理反应的过程,致残、致死率高。而继发性脑水肿是TBI后脑挫伤组织必然经历的病理变化过程,加重患者病情及神经功能损伤。研究报道SUR1、TRPM4和AQP4的表达与脑病损后脑水肿的形... 详细信息

目的:创伤性脑损伤(TBI)指脑部遭受外力损伤后引起一系列病理反应的过程,致残、致死率高。而继发性脑水肿是TBI后脑挫伤组织必然经历的病理变化过程,加重患者病情及神经功能损伤。研究报道SUR1、TRPM4和AQP4的表达与脑病损后脑水肿的形成关系密切,但目前仍处于动物模型研究探索阶段,那么人挫伤脑组织中SUR1、TRPM4和AQP4的表达在脑水肿的发生发展及其蛋白表达浓度与患者预后的关系值得我们进一步探讨。方法:收集30例TBI患者挫伤脑组织为实验组,根据伤后时间长短分为12h组15例、12～24h组8例和>24h组7例;同期收集良性肿瘤术中造瘘获得的正常脑组织10例为正常对照组。HE染色观察脑组织细胞结构完整性及水肿程度。Western blot检测SUR1、TRPM4和AQP4蛋白动态表达水平;免疫荧光染色观察SUR1、TRPM4和AQP4空间表达分布及荧光强度变化;随访患者术后3～6个月GOS评分变化判断蛋白表达水平与患者预后的相关性。结果:1.HE染色结果:TBI后脑组织完整细胞数量减少,细胞排列凌乱、稀疏,随受伤时间延长,空泡样或气球样变增多,胞核出现皱缩、溶解或碎裂。2.Western blot结果:TBI后AQP4表达量呈动态变化,12h就可在脑组织中表达增加,但与正常对照组对照无显著差异(P>0.05),12～24h表达量达到峰值,随后下降(PSUR1、TRPM4表达量随受伤时间延长,呈现递增趋势(PSUR1、TRPM4及AQP4荧光表达在TBI后增加并相互共定位(PSUR1、TRPM4和AQP4表达量与患者术后3～6月的GOS评分呈负相关趋势(r1.TBI后早期,随着受伤时间延长,脑水肿逐渐加重,神经细胞破坏增加。2.SUR1、TRPM4及AQP4在TBI后表达上调参与脑水肿的形成,并可能相互共聚合成异聚体加重脑水肿。3.SUR1、TRPM4及AQP4蛋白表达量在评估TBI患者预后具有重要参考意义。

关键词： SUR1 TRPM4 AQP4 创伤性脑损伤表达作用预后

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ATP结合盒转运蛋白亚家族C成员8基因突变相关疾病研究进展

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中国医学前沿杂志（电子版） 2023年第12期15卷 42-49页

作者：聂辰宇吕晓宇侯新国山东大学齐鲁医院内分泌科山东济南250012

ATP结合盒转运蛋白亚家族C成员8 (ATP binding cassette subfamily C member 8,ABCC8)基因编码磺脲受体1 (sulfonylurea receptor 1,SUR1)亚基,该亚基是腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP通道)的一部分。在胰岛β细胞中,SUR1亚基通过影响KATP通道调控胰岛素分泌。ABCC8的致病突变主要包括激活和失活突变两种类型,不同类型、相同类型不同结构域的突变引起疾病的临床表现、生化特征都不尽相同。对典型的临床表现及基因突变特点之间关系的深入认识有助于对该类疾病的精准诊断与治疗。

关键词： ABCC8基因 SUR1 新生儿糖尿病先天性高胰岛素血症青少年起病的成人型糖尿病

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SUR1和KCNJ11基因多态性与磺脲类药物继发性失效的相关性研究

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中国药理学通报 2013年第7期29卷 927-931页

作者：邵倩班博施锦绣山东大学医学院山东济南250012 济宁医学院附属医院内分泌科山东济宁272029 上海人类基因组研究中心上海201203

目的探讨磺脲类药物受体1(SUR1)基因的外显子16-3c/t、内向整流性钾通道(potassium inwardly-rectifying channel subfamily J,member 11,KCNJ11)基因的E23K变异与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者磺脲类药物继发性失效(secondary failure of sulfonylurea,SFS)的关系。方法选取山东地区T2DM患者200例,其中磺脲类药物有效者114例,SFS者86例,运用SNaPshot技术(ABI Biosystem,USA)对SUR1 16-3c/t、KCNJ11 E23K进行基因分型。结果 SUR1 16-3c/t和KCNJ11 E23K等位基因的发生频率均符合Hardy-Weinberg平衡;KCNJ11 E23K各基因型的分布在SFS组及有效组之间差异无统计学意义(P>0.05);SUR116-3c/t各基因型的分布在SFS组和有效组之间差异有统计学意义(P1),且"t"等位基因的频率在SFS组明显增高[比值比(OR)=1.87,95%可信区间(CI)为1.23～2.85,P1]。Logistic回归分析中,校正性别、年龄、BMI、F-C肽、TG、TC、HDL-C、LDL-C后,SUR1 16-3c/t的t/t基因型是SFS发生的独立危险因素[比值比(OR)=2.82,95%可信区间(CI)为1.57～5.07,P1]。结论 SUR1外显子16-3c/t多态性可能与山东地区磺脲类药物继发性失效有明显相关性。

关键词： 2型糖尿病磺脲类药物基因多态性 SNaPshot技术 SUR1 KCNJ11

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SUR1和UCP2基因多态性与2型糖尿病相关性及其对瑞格列奈疗效的影响

SUR1和UCP2基因多态性与2型糖尿病相关性及其对瑞格列奈疗效的影响

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作者：佘艳梅中南大学

学位级别：硕士

目的:胰岛素分泌有赖于胰岛β细胞膜ATP敏感性钾离子(K)通道的关闭,磺脲类受体1(SUR1)和解偶联蛋白2(UCP2)可通过影响胰岛β细胞K通道而影响胰岛素分泌,并介导非磺脲类胰岛素促泌剂瑞格列奈的降糖作用。本研究旨在了解SUR1基因16外显子-... 详细信息

目的:胰岛素分泌有赖于胰岛β细胞膜ATP敏感性钾离子(K)通道的关闭,磺脲类受体1(SUR1)和解偶联蛋白2(UCP2)可通过影响胰岛β细胞K通道而影响胰岛素分泌,并介导非磺脲类胰岛素促泌剂瑞格列奈的降糖作用。本研究旨在了解SUR1基因16外显子-3c/t和UCP2基因启动子区-866G/A的多态性在正常人群及2型糖尿病(T2DM)人群的分布特征,探讨该遗传多态性与T2DM关系及其对瑞格列奈疗效的影响。方法:随机选取湖南地区370名(185名男性/185名女性)T2DM患者及166名(95名男性/71名女性)健康志愿者,从其外周血白细胞提取DNA,采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)进行基因型分析并测序验证。根据不同基因型选取60名(每种基因型各20名)T2DM患者进入临床试验,口服瑞格列奈1mgTid,持续12周。服药前和服药第12周末收集血标本检测糖化血红蛋白(HbAlc),空腹血糖(FBG)和血胰岛素(FINS)及馒头(100克)餐后30、60、120分钟血糖(PBG30、PBG60、PBG120)和血胰岛素(PINS30、PINS60、PINS120)。并计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),稳态模型胰岛β细胞功能指数(HOMA-β),早期胰岛素分泌指数[ΔI/ΔG=(PINS30-FINS)/(PBG30-FPG)]。应用单因素方差分析、卡方检验和配对t检验进行统计学分析。结果:(1)对370名中国汉族T2DM患者以及166名健康对照者进行了SUR1和UCP2基因分型,发现等位基因的发生频率均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)SUR1基因16-3t等位基因频率在T2DM患者及其健康对照人群中分别为56.2%和48.2%,存在显著性差异(P＜0.05);进一步研究发现该基因不同基因型T2DM患者HbAlc、PINS30、PINS60和ΔI/ΔG存在显著性差异(P＜0.05),表现为tt基因型的HbAlc高于cc、ct型,而PINS30、PINS60低于cc型,cc基因型的ΔI/ΔG高于ct、tt基因型;瑞格列奈治疗12周后,各基因型之间无显著差异(P＞0.05);(3)UCP2基因-866A等位基因频率在T2DM患者及其健康对照人群中分别为46.6%和45.5%,无显著性差异(P＞0.05);但该基因不同基因型T2DM患者FBG、PBG30、PBG60、PBG120、HbAlc以及PINS30、PINS60、PINS120、HOMA-β、ΔI/ΔG存在显著性差异(P＜0.05),表现为AA基因型的FBG、PBG30、PBG60、PBG120、HbA1c高于GG型,而PINS30、PINS60、PINS120、HOMA-β、ΔI/ΔG低于GG型;瑞格列奈使用12周后,GG型患者用药后PINS30上升值HbAlc下降值明显高于AA型患者(P＜0.05)。结论:(1)SUR1基因16-3c/t等位基因频率在T2DM患者及健康对照人群中有明显差异,可能与中国湖南地区汉族人群T2DM相关,且对胰岛素分泌功能可能存在影响,但对瑞格列奈在T2DM中的疗效无明显影响。(2)UCP2基因-866G/A等位基因频率在T2DM患者及健康对照人群中无明显差异,但其基因多态性可能影响T2DM患者胰岛素分泌功能,同时有可能影响瑞格列奈升高PINS30和降低HbAlc的作用。

关键词： SUR1 UCP2 基因多态性 2型糖尿病瑞格列奈

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运动预处理对脑缺血/再灌注大鼠脑组织mitoKATP通道蛋白Kir6.2、SUR1表达的影响

运动预处理对脑缺血/再灌注大鼠脑组织mitoKATP通道蛋白Kir6.2、S...

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作者：李宏玉黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

目的:探讨运动预处理对脑缺血再灌注大鼠脑组织mitoKATP通道蛋白Kir6.2、SUR1表达的影响,阐明其脑保护机制。方法:采用随机数字表法随机将36只大鼠分为模型组、假手术组、运动预处理组,每组12只（n = 12）。采用改良线栓法制备大鼠脑缺... 详细信息

目的:探讨运动预处理对脑缺血再灌注大鼠脑组织mitoKATP通道蛋白Kir6.2、SUR1表达的影响,阐明其脑保护机制。方法:采用随机数字表法随机将36只大鼠分为模型组、假手术组、运动预处理组,每组12只（n = 12）。采用改良线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注（I/R）损伤模型。缺血再灌注2h、12h、24h后采用神经功能缺损评分评价各组大鼠神经功能损伤。缺血再灌注24h后,HE染色法观察各组大鼠缺血半暗区皮质区病理形态变化;western blot法检测各组大鼠mitoKATP通道蛋白kir6.2、SUR1蛋白的表达;TUNEL染色检测各组大鼠缺血半暗区皮质区神经细胞凋亡的表达。结果:1.神经功能缺损评分:脑缺血再灌注2h、12h、24h后,与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）,脑缺血再灌注24h后,与模型组比较,运动预处理组大鼠神经功能缺损评分明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.病理组织学变化:脑缺血再灌注24h后,假手术组脑组织结构层次分明,神经细胞形态与结构均正常,模型组缺血半暗区皮质区可见间质水肿,结构疏松成片状分布,神经细胞排列紊乱,空泡样改变明显,细胞核固缩深染等,缺血半暗区皮质区周围炎性浸润明显;与模型组对比,运动预处理组脑组织病理损伤程度减轻,脑水肿及炎性浸润有所缓解,神经元数量有所增加,变性、坏死神经元相应减少。3.缺血半暗区皮质区kir6.2、SUR1蛋白的表达:脑缺血再灌注24h后,与假手术组比较,模型组Kir6.2、SUR1蛋白水平上调,差异显著（P＜0.05）。与模型组比较,运动预处理组Kir6.2、SUR1蛋白水平下调,差异显著(P＜0.05=。4.缺血半暗区皮质区神经细胞凋亡情况:脑缺血再灌注24h后,与假手术组比较,模型组TUNEL阳性细胞明显增多,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,运动预处理组TUNEL阳性细胞明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.运动预处理可降低神经功能缺损评分,减轻缺血半暗区皮质区病理损伤,降低脑缺血/再灌注大鼠神经功能损伤。2.运动预处理可通过下调脑缺血/再灌注大鼠缺血半暗区皮质区Kir6.2、SUR1蛋白的表达,抑制缺血半暗区皮质区神经细胞调亡,发挥神经保护作用。

关键词：运动预处理脑缺血/再灌注损伤 Kir6.2 SUR1 细胞调亡

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格列齐特对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

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中国医院药学杂志 2016年第11期36卷 916-920页

作者：车飞胡斌王坤刘洋付金霞庄源齐齐哈尔医学院附属第二医院神经内二科黑龙江齐齐哈尔161000 黑龙江省医院黑龙江哈尔滨150030

目的：以大脑中动脉栓塞（MCAO）/再灌注模型为研究对象,探讨格列齐特对缺血性脑卒中的保护作用及机制。方法：雄性Wistar大鼠采用线栓法进行2 h左侧MCAO/再灌注,对不同再灌注时间点的梗死核心区样本检测mRNA水平及SUR1蛋白表达水平;不... 详细信息

目的：以大脑中动脉栓塞（MCAO）/再灌注模型为研究对象,探讨格列齐特对缺血性脑卒中的保护作用及机制。方法：雄性Wistar大鼠采用线栓法进行2 h左侧MCAO/再灌注,对不同再灌注时间点的梗死核心区样本检测mRNA水平及SUR1蛋白表达水平;不同剂量格列齐特静脉注射到右颈内静脉后灌注12 h,采用TUNEL法检测凋亡细胞数量、采用Bederson试验评价神经功能缺损、采用TTC染色法观察脑梗死体积。结果：SUR1 mRNA和蛋白水平在MCAO/再灌注组织中显著上调,在缺血后8~12 h达到最大水平。格列齐特可减少TUNEL阳性细胞数量,减轻神经功能损伤和脑梗死体积。结论：研究表明SUR1信号通路可能与MACO/再灌注损伤及梗死相关,静脉注射格列齐特可通过抑制SUR1的表达减轻梗死程度,减少MACO/再灌注造成的梗死面积及脑细胞凋亡程度。

关键词：格列齐特 SUR1 NCCa-ATP 脑缺血/再灌注模型保护作用

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格列苯脲通过靶向SUR1调控p70S6K信号通路抑制非小细胞肺癌生长的作用机制研究

格列苯脲通过靶向SUR1调控p70S6K信号通路抑制非小细胞肺癌生长的...

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作者：徐可心南京医科大学

学位级别：硕士

肺癌是全世界最常见的肿瘤,在中国的发病率和死亡率也居肿瘤相关死亡的首位。尽管肺癌的早期诊断和治疗方面取得了一定进展,但大多数患者确诊时已经处于中晚期,所以化疗仍然是主要的治疗手段。因此阐明肿瘤的发病机制,为治疗提供新靶点... 详细信息

肺癌是全世界最常见的肿瘤,在中国的发病率和死亡率也居肿瘤相关死亡的首位。尽管肺癌的早期诊断和治疗方面取得了一定进展,但大多数患者确诊时已经处于中晚期,所以化疗仍然是主要的治疗手段。因此阐明肿瘤的发病机制,为治疗提供新靶点和新策略尤为重要。格列苯脲是一种传统的抗糖尿病药物,有研究报道了其对某些肿瘤的抗癌作用,但其对非小细胞肺癌的作用和机制仍不明确。磺酰脲受体1(SUR1)是格列苯脲的受体,是ATP敏感钾通道(K)的调节亚单位。在胰岛β细胞中,格列苯脲与SUR1结合以后,关闭K通道,促进胰岛素释放。目前,关于SUR1在肿瘤中的表达和作用机制仍不明确。本研究中,我们发现格列苯脲抑制非小细胞肺癌细胞的生长、引起细胞周期阻滞于G1期,并抑制p70S6K的活性。敲降SUR1可抑制细胞生长及下调p70S6K的活性,与格列苯脲的作用一致;而过表达SUR1作用相反,表现为促进细胞生长和上调p70S6K的活性。进一步研究发现,过表达p70S6K,可以部分取消格列苯脲对细胞生长的抑制作用,反之,敲降p70S6K的表达可以增强格列苯脲的作用。进一步研究发现SUR1与p70S6K蛋白间存在直接结合,格列苯脲可以促进二者的结合;格列苯脲同时引起m TOR复合物1的解聚,可能是其抑制p70S6K活性的作用机制。我们在裸鼠异种移植瘤模型上,研究发现格列苯脲处理或稳定敲降SUR1的表达均抑制A549肿瘤的生长且下调p70S6K信号通路。最后,我们利用Oncomine数据库和Kaplan生存期数据库,分析发现SUR1在肺癌患者肿瘤组织中的表达增高,低表达肺癌患者的生存期较长。本研究发现了格列苯脲抑制非小细胞肺癌的作用,以及靶向SUR1,通过直接结合及抑制m TORC1的作用下调p70S6K信号通路的分子机制。这些发现为靶向SUR1和使用抗糖尿病药物格列苯脲进行非小细胞肺癌治疗提供了理论依据和实验证据。

关键词：非小细胞肺癌 SUR1 p70S6K 格列苯脲

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西兰花SUR1基因的克隆与功能分析

西兰花SUR1基因的克隆与功能分析

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作者：张文宇东北农业大学

学位级别：硕士

西兰花(Brassica oleracea var.italica)又名花椰菜、绿菜花,是十字花科(Brassicace ae)芸薹属(Brassica)植物中的一种重要作物,在我国被广泛种植。西兰花原产于意大利,19世纪末20世纪初传到我国,被誉为“蔬菜皇冠”,其花蕾和茎叶均具... 详细信息

西兰花(Brassica oleracea var.italica)又名花椰菜、绿菜花,是十字花科(Brassicace ae)芸薹属(Brassica)植物中的一种重要作物,在我国被广泛种植。西兰花原产于意大利,19世纪末20世纪初传到我国,被誉为“蔬菜皇冠”,其花蕾和茎叶均具有丰富的营养物质,富含蛋白质、胡萝卜素、维生素及各种矿物质。但西兰花真正引起科学家们兴趣的是其卓越的抗癌功效,研究表明经常食用西兰花可有效降低人们罹患多种不同肿瘤疾病如胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌及胃癌等的风险,存在于西兰花中的具有抗癌活性的物质是一种异硫氰酸盐,异硫氰酸盐是次生代谢物质芥子油苷水解后的产物,因此研究西兰花中芥子油苷的代谢意义重大。本研究以西兰花为实验材料,参考前期工作中西兰花转录组测序结果,通过RACE方法克隆了西兰花芥子油苷合成途径的关键酶基因SUR1的mRNA全长,并将其转入模式植物拟南芥中,通过过量表达BoSUR1的转基因拟南芥的主要表型验证了Bo SUR1的功能,并将其命名为Bo SUR1。为深入探讨西兰花芥子油苷的代谢及利用基因工程方法培育具有较高芥子油苷含量和抗癌活性的西兰花品种提供了理论参考和基因资源。本论文的主要研究结果:(1)克隆获得了西兰花Bo SUR1基因mRNA全长序列。Bo SUR1基因CDS序列全长1371bp,编码蛋白质含456个氨基酸残基,分子量50.45KD,。BLAST结果表明:该基因与芜菁亚种(EF611275.1、EF611274.1、EF611276.1、EF611273.1)、甘蓝型油菜(EF611272.1)、卷心菜(EF611271.1)、白菜(FJ376052.1)、小白菜(EF611278.1)具有98%的同源性,与芝麻菜亚种(JX946194.1)具有94%同源性,与山嵛菜(XM06408931.1)具有92%同源性,与拟南芥具有88%的同源性。(2)获得过量表达Bo SUR1基因的转基因拟南芥,为验证及深入研究Bo SUR1的功能奠定了物质基础。(3)对35S::Bo SUR1转基因拟南芥进行表型分析结果显示,脂肪族芥子油苷含量升高显著,吲哚族芥子油苷含量升高不显著,验证了Bo SUR1基因可参与脂肪族芥子油苷和吲哚族芥子油苷的合成。本研究的意义:西兰花中Bo SUR1基因的克隆及功能的验证,为深入探讨西兰花中芥子油苷的合成代谢及培育具有较高含量芥子油苷的西兰花新品种奠定了基础。

关键词：西兰花 SUR1 拟南芥芥子油苷 IAA

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硫化氢供体的表征及其上调Kir6.2、SUR1的表达抑制癫痫的机制研究

硫化氢供体的表征及其上调Kir6.2、SUR1的表达抑制癫痫的机制研究

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作者：王林杰广州医科大学

学位级别：硕士

目的:首先,观察硫化氢供体的表面体征及吸收光谱,检测硫化氢供体对急性分离海马神经元和人喉癌上皮细胞系Hep-2细胞活性的影响以及光学成像作用;其次,在细胞水平,原代培养海马神经元并鉴定,硫化氢供体与海马神经元共培养,无镁细胞外液... 详细信息

目的:首先,观察硫化氢供体的表面体征及吸收光谱,检测硫化氢供体对急性分离海马神经元和人喉癌上皮细胞系Hep-2细胞活性的影响以及光学成像作用;其次,在细胞水平,原代培养海马神经元并鉴定,硫化氢供体与海马神经元共培养,无镁细胞外液处理建立癫痫细胞模型,观察硫化氢供体对海马神经元的细胞活性的影响,检测海马神经元Kir6.2、SUR1 mRNA的表达,深入探讨细胞内硫化氢供体对海马神经元的保护作用及机制;最后,在动物水平,建立动物癫痫模型,侧脑室注射硫化氢供体,观察行为学表现、记录脑电,免疫组化检测Kir6.2在海马及皮层中的表达,检测皮层及海马组织中Kir6.2、SUR1蛋白和mRNA的表达,深入探讨硫化氢供体对癫痫的抑制作用及机制。方法:第一部分:透射电镜下观察硫化氢供体的表征情况,进行硫化氢供体吸收光谱的测定,用CCK-8试剂盒检测硫化氢供体对原代海马神经元和人喉癌上皮细胞系Hep-2的细胞活性的影响,并筛选出硫化氢供体作用的最大安全浓度和作用时间,用激光共聚焦检测硫化氢供体在两种细胞内的吸收以及发光通道情况。第二部分:在细胞水平上,进一步探索硫化氢供体对海马神经元的作用及机制,原代培养新生SD大鼠海马神经元,NSE/DAPI双染法进行鉴定,无镁细胞外液处理3 h建立癫痫细胞模型。我们将海马神经元分为5组:(1)对照组(Control),正常细胞外液处理3 h;(2)癫痫细胞模型组(EPI),用无镁细胞外液处理3 h;(3)硫化氢供体干预组(HS Donor+EPI),用配有400μM硫化氢供体的培养基培养12 h,用无镁细胞外液处理3 h;(4)硫化氢供体空白对照组(HS Donor),用配有400μM硫化氢供体的培养基培养,用正常细胞外液处理3 h;(5)羟胺对照组(HA+EPI),用配有100 mM羟胺的培养基培养12 h,用无镁细胞外液处理3 h。用RT-qPCR法检测各组海马神经元Kir6.2、SUR1mRNA的表达。第三部分:在动物水平上,进一步探索硫化氢供体对癫痫的作用及机制,我们将大鼠随机分为5组:(1)对照组(Control),侧脑室注射生理盐水,腹腔注射生理盐水;(2)癫痫持续状态组(SE),侧脑室注射生理盐水,腹腔注射戊四氮;(3)硫化氢供体干预组(HS Donor+SE),侧脑室注射500μM硫化氢供体,再腹腔注射戊四氮;(4)硫化氢供体空白对照组(HS Donor),侧脑室注射500μM硫化氢供体,腹腔注射生理盐水;(5)羟胺对照组(HA+SE),侧脑室注射生理盐水,腹腔注射羟胺12.5 mg/kg,30 mins后再腹腔注射戊四氮。观察造模后各组大鼠行为学表现,记录大鼠首次诱发癫痫样放电潜伏期时间及持续时间,并使用BL-420生物信号系统记录各组大鼠脑电图的变化;通过免疫组化的方法检测各组海马及皮层中Kir6.2的定位和表达,用Western blot和RT-qPCR法检测皮层和海马组织中Kir6.2、SUR1蛋白和mRNA的表达。结果:第一部分结果:1、扫描电镜:扫描电镜观察硫化氢供体的表征形貌,硫化氢供体的微观形态呈现出由许多微管组成的均匀微团,这些管表现出高度的结晶度和规律性。2、吸收光谱:吸收光谱的特征峰,硫化氢供体在230 nm处至310 nm处对光有强吸收,作为参考在吸收峰附近选择激发硫化氢供体的荧光波长。3、CCK-8结果:根据实验结果,我们选择最佳浓度为400μM,优化时间为12 h以检测体外光学成像。4、激光共聚焦结果:共聚焦观察与硫化氢供体共培养12小时后海马神经元和Hep-2的荧光发光情况。硫化氢供体在细胞摄取后仍具有高荧光发射性质。第二部分结果:1、NSE/DAPI双染法:经NSE抗体染色后进一步证实培养的细胞主要为神经元,占总细胞的90%左右。2、CCK-8法:无镁细胞外液处理3h后,EPI组、HS Donor+EPI组、HA+EPI组相比Control组细胞活性下降;与EPI组相比,HS Donor+EPI组、HS Donor组细胞活性增高。3、RT-qPCR检测海马神经元Kir6.1、sur2 mRNA的表达:无镁细胞外液处理3h后,EPI组、HA+EPI组与Control组相比大鼠海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达均降低;HS Donor+EPI组、HS Donor组海马组织Kir6.2、SUR1mRNA表达与SE相比表达增高。第三部分结果:1、行为学:Control、HS Donor组的大鼠行为学表现正常,无发作。而SE组的大鼠出现癫痫发作,表现为Ⅳ级;HS Donor+SE组的大鼠癫痫潜伏期明显延长,发作的级别也降低,表现为Ⅰ级或Ⅱ级,与SE组相比较,潜伏期延长,发作持续时间也缩短。2、脑电图:Control、HS Donor组并没有出现棘波或棘-慢综合波,为正常的脑电图波形。SE组、HA+SE可以记录到明显的尖波、棘波或棘-慢综合波,波幅较大,波幅

关键词：癫痫硫化氢硫化氢供体 Kir6.2 SUR1

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