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s-腺苷-l-甲硫氨酸的分离纯化及其稳定盐的制备过程

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S-腺苷-L-甲硫氨酸的分离纯化及其稳定盐的制备过程

作者：赵晓星浙江大学

学位级别：硕士

s—腺苷—l—甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,简称sAM,sAMe或AdoMet)是一种重要的中间代谢产物,广泛存在于各种生物体中,也是人体内一种重要的生理活性物质。本文主要研究了温度及pH对sAM稳定性的影响;sAM的分离纯化;sAM硫酸盐,sAM... 详细信息

s—腺苷—l—甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,简称sAM,sAMe或AdoMet)是一种重要的中间代谢产物,广泛存在于各种生物体中,也是人体内一种重要的生理活性物质。本文主要研究了温度及pH对sAM稳定性的影响;sAM的分离纯化;sAM硫酸盐,sAM对甲苯磺酸硫酸双盐,sAM1,4—丁二磺酸盐的制备;sAM硫酸盐,sAM对甲苯磺酸硫酸双盐的热稳定性。对sAM稳定性进行研究表明,在4℃的条件下,pH从3.0上升到7.0,sAM的降解速率常数k由1.810×10 glh增加到4.817×10 glh,降解速度随pH升高而加快;在pH=3.0的条件下,温度从50℃增加到70℃,降解速率常数kd从4.44×10—2 gl-1h-1增大到7.11×10—1 gl-1h-1,随温度提升迅速加快。采用离子交换法从细胞提取液中分离纯化sAM。此法相对于传统的使用苦味酸,苦酮酸选择沉淀sAM的方法,提高了sAM的回收率,而且减小了操作的危险性和对环境的污染。研究得出sAM提取液在JK110弱酸性离子交换树脂上的最佳上柱条件为:sAM浓度:4.98g/l;流速:2BV/h;sAM料液pH:5.0。以硫酸作为洗脱剂洗脱sAM,得出最佳洗脱条件为0.1mol/l的硫酸,流速2BV/h。流速对洗脱效果基本没有影响。sAM洗脱效率为91.9%。采用有机反相沉淀的方法制备sAM硫酸盐,并在此基础上优化sAM对甲苯磺酸硫酸双盐的制备工艺,解决了以往稳定盐制备中结晶收率低,纯度低的问题。所得sAM硫酸盐产品收率为97.0%,纯度92%;sAM对甲苯磺酸硫酸双盐收率为87.5%。对两种稳定盐的热稳定性进行研究表明,sAM对甲苯磺酸硫酸双盐的热稳定性得到极大的改善。在45℃的条件下,30天后,sAM硫酸盐中有效成分降解了61.0%,而在sAM对甲苯磺酸硫酸双盐中,仅降解了18.4%。在1,4—丁二磺酸二钠盐的制备过程中由于表面活性剂EDTA的加入,反应时间由文献中的72h缩短到3h,反应转化率达到99.39%。此外,采用HPCE建立1,4—丁二磺酸的检测方法。该方法的线性相关系数0.9989,日内变异系数0.05%,日间变异系数0.9%,回收率96.30%。该方法准确性高、重现性好、灵敏度高,非常适合于1,4—丁二磺酸二钠盐含量的测定。以1,4—丁二磺酸洗脱sAM。得出浓度为0.2mol/l为合适的洗脱浓度,洗脱峰集中,洗脱效率为96.17%;流速对洗脱效率影响不大。收集洗脱液,过大孔吸附树脂柱后经喷雾干燥得到sAM1,4—丁二磺酸产品。本文旨在开发并完善已有的sAM分离纯化工艺,建立一条低成本,高产率的sAM稳定性盐的制备途径,为sAM工业化应用打下良好基础。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸 sAM sAM稳定性盐 JK110弱阳离子交换树脂 sAM硫酸盐 sAM对甲苯磺酸硫酸双盐 1,4-丁二磺酸

s-腺苷-l-甲硫氨酸（sAM）荧光探针的开发

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S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）荧光探针的开发

作者：李景辉河南大学

学位级别：硕士

s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)是所有生物中甲基的主要供体,参与多种代谢过程与基因的表达调控。近年来越来越多的研究表明,sAM与表观遗传修饰和多种疾病的发生有着密切的联系,维持正常的sAM水平对各种各样的生物过程至关重要。目前,人们对于... 详细信息

s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)是所有生物中甲基的主要供体,参与多种代谢过程与基因的表达调控。近年来越来越多的研究表明,sAM与表观遗传修饰和多种疾病的发生有着密切的联系,维持正常的sAM水平对各种各样的生物过程至关重要。目前,人们对于sAM的检测手段多依赖于高效液相色谱(HPlC)、高效液相色谱与质谱联用(HPlC-Ms)、酶联免疫吸附(Elisa)等方式,这些方式难以清楚的检测到整个细胞代谢调控过程中sAM的变化情况,进而无法精确的了解sAM参与调控的具体机制。为了能更好的研究生物体内sAM动态变化对生物的具体影响,开发一种能实时动态监测活细胞内sAM水平的变化的探针就十分必要。近年来,依靠荧光共振能量转移(FRET)的基因编码荧光探针凭借着其高灵敏度与低误差备受研究者的青睐,被广泛的应用于检测多种信号分子与代谢产物,如ATP、Ca、糖类、氨基酸、ROs、激素等代谢分子,为相关领域的研究做出了重大的贡献。因此,我们开发了一种基于FRET原理能实时监测细胞中sAM变化的荧光探针。我们首先通过检索sAM结合蛋白,分析比较sAM结合蛋白的结构,筛选出了5种适合作为探针报告蛋白的sAM结合蛋白,根据每种蛋白质与sAM结合的机制设计构建了6种探针载体,分别命名为sFP-1、sFP-2、sFP-3、sFP-4、sFP-5、sFP-6。经过在大肠杆菌中的初步筛选,得到了两个对sAM有响应的探针sFP-5与sFP-6,进一步在大肠杆菌上比较两个探针在对加入sAM后,在时间和浓度以及底物特异性上的差异,发现sFP-6有着更好的sAM响应性能。之后,我们构建了sFP-6探针的真核表达载体,发现sFP-6在多种哺乳动物细胞中都有着良好的表达效果。在HEK293T细胞中验证了sFP-6探针可以检测到sAM浓度的变化。利用Piggy Bac转座系统构建出了能稳定表达探针的细胞系HEK293T-sFP-6,通过检测野生型HEK293T与HEK293T-sFP-6细胞的增殖活力,验证了sFP-6探针稳定表达对细胞具有较小的毒性。构建了sAM合成酶MAT2A过表达载体p PBCAG-MAT2A-Puro与MAT2A干扰载体p lKO.1-sh RNA1-MAT2A-puro、p lKO.1-sh RNA2-MAT2A-puro,分别转染到HEK293T-sFP-6细胞中,检测转染后Day 1、Day 2、Day 3时MAT2A的转录水平、蛋白质水平以及细胞中sAM水平。使用共聚焦拍摄了Day 3时细胞的荧光情况,计算分析其FRET ratio值,验证了sFP-6探针能在过表达与干扰sAM合成酶MAT2A体系中指示sAM的浓度变化。最后,我们使用含有不同浓度的甲硫氨酸培养体系对HEK293T-sFP-6细胞进行3天的培养,探针的荧光结果显示,低浓度的甲硫氨酸供给大幅降低了细胞内sAM的含量,高浓度的甲硫氨酸也引起了细胞内sAM浓度的小幅下降,这与我们质谱检测的结果相吻合,证明了sFP-6探针可以指示由于不同浓度甲硫氨酸引起的细胞内sAM浓度变化,进一步对甲硫氨酸代谢循环中的关键酶进行分析,发现在低浓度甲硫氨酸供给时,MAT2A、MAT2B、sUV39H1有较高的表达水平,而在高甲硫氨酸供给时MAT2A、MAT2B、sUV39H1、sAHH、MTR基因的表达都出现了下调的趋势。综上,本研究开发了一种能实时监测sAM浓度的荧光探针,为研究sAM在基因表达或抑制以及众多的代谢过程中浓度的变化提供监测手段,对了解sAM在生物过程中的机制研究具有指导意义。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸 FRET 荧光探针 MAT2A 甲硫氨酸

s-腺苷-l-甲硫氨酸的分离纯化及其硫酸盐制备的研究

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S-腺苷-L-甲硫氨酸的分离纯化及其硫酸盐制备的研究

作者：杨羽辉浙江工商大学

学位级别：硕士

s-腺苷-l-甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,简称sAM, sAMe或AdoMet)是一种重要的中间代谢产物,广泛存在于各种生物体中,也是人体内一种重要的生理活性物质。本文主要研究了破碎细胞抽提sAM的方法;sAM的分离纯化;sAM硫酸盐的制备;sAM... 详细信息

s-腺苷-l-甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,简称sAM, sAMe或AdoMet)是一种重要的中间代谢产物,广泛存在于各种生物体中,也是人体内一种重要的生理活性物质。本文主要研究了破碎细胞抽提sAM的方法;sAM的分离纯化;sAM硫酸盐的制备;sAM硫酸盐的稳定性。对破碎细胞抽提sAM的方法进行研究表明,采用甲酸进行破碎抽提效果最好,优化得出最佳破碎提取条件：甲酸浓度：0.5mol/l,甲酸用量：1.25BV发酵液体积,破碎时间：90min。sAM提取率以高氯酸的破碎率为1,能达到95%以上。采用离子交换法从细胞提取液中分离纯化sAM。此法相对于传统的使用苦味酸,苦酮酸选择沉淀sAM的方法,提高了sAM的回收率,而且减小了操作的危险性和对环境的污染。研究得出sAM提取液在D113弱酸性阳离子交换树脂上的sAM最佳上柱初始pH值为5.0。以硫酸作为洗脱剂洗脱sAM,得出最佳洗脱条件为0.2mol/l的硫酸,流速2BV/h。sAM洗脱效率为90.3%。采用有机反相沉淀的方法制备sAM硫酸盐,优化sAM硫酸盐的结晶工艺。通过实验得到,选用80%甲醇浓度比例,甲醇用量5BV进行结晶,该条件下结晶状况最好。sAM硫酸盐回收率达到70%以上,产品纯度达到91.05%。sAM硫酸盐的稳定性仍受pH和温度的影响。但温度对sAM硫酸盐的稳定性影响较大,随温度升高,降解速率明显加快,损失量显著增加。因此,sAM硫酸盐的保存应在低温(0℃)下保存。本文旨在完善sAM分离纯化工艺,提高sAM破碎提取率,优化整条工艺流程,减少sAM损失,为sAM工业化应用打下良好基础。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸 sAM 细胞破碎 D113弱酸性阳离子交换树脂离子交换分离纯化 sAM硫酸盐 sAM硫酸盐的稳定性

发酵法制备s-腺苷-l-甲硫氨酸的研究进展

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食品工业科技 2011年第9期32卷 435-438页

作者：陈原肖冬光天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室天津300457

s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。sAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化... 详细信息

s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)是甲硫氨酸和ATP相结合的代谢产物,广泛存在于动植物和微生物体内,参与40多种生化反应,临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。sAM制备方法包括化学合成法、微生物发酵法、体外酶促转化法以及全细胞催化法。详细阐述了sAM的微生物发酵制备方法的国内外研究现状。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸微生物发酵法研究进展

HPlC-UV法定量测定发酵液中的s-腺苷-l-甲硫氨酸

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中国生物工程杂志 2007年第11期27卷 73-76页

作者：蔡恒郑伟刚万红贵郭一丹王涛南京工业大学制药与生命科学学院南京210009

采用高效液相色谱-紫外检测器(HPlC-UV)定量测定发酵液中s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)的含量。结果表明,s-腺苷-l-甲硫氨酸浓度在0.1～1.0g/l时,其峰面积(Y)与相应的浓度(X)呈线性关系,线性方程为Y=13.937X-0.1949,相关系数为0.9969。s-腺苷... 详细信息

采用高效液相色谱-紫外检测器(HPlC-UV)定量测定发酵液中s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)的含量。结果表明,s-腺苷-l-甲硫氨酸浓度在0.1～1.0g/l时,其峰面积(Y)与相应的浓度(X)呈线性关系,线性方程为Y=13.937X-0.1949,相关系数为0.9969。s-腺苷-l-甲硫氨酸的平均回收率为99.89%～101.7%,相对标准偏差为0.48%～1.36%。该方法精密度、准确度好,稳定性高,能简便、快速、准确地测定发酵液中s-腺苷-l-甲硫氨酸的含量。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸 HPlC UV

酿酒酵母中分离提取谷胱甘肽(GsH)和s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)

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酿酒酵母中分离提取谷胱甘肽(GSH)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)

作者：张冰北京化工大学

学位级别：硕士

谷胱甘肽(GsH)和s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)均是广泛存在于生物活细胞中的生理活性物质,具有重要的生理功能,广泛应用于临床医学和食品保健领域。微生物发酵法是目前生产GsH和sAM的主要方法,最常用的生产菌种为酵母菌,二者均为酵母胞内代... 详细信息

谷胱甘肽(GsH)和s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)均是广泛存在于生物活细胞中的生理活性物质,具有重要的生理功能,广泛应用于临床医学和食品保健领域。微生物发酵法是目前生产GsH和sAM的主要方法,最常用的生产菌种为酵母菌,二者均为酵母胞内代谢产物,而酵母本身含有的酵母多糖也具有很高的利用价值。本课题主要研究发酵法生产GsH和sAM的分离纯化工艺优化与放大,以及废弃酵母细胞菌泥中p-葡聚糖的分离提取,建立酵母综合利用工艺路线。具体内容如下：(1)利用酿酒酵母发酵生产GsH,采用新型合成培养基替代传统天然培养基,产量达到2g/l。建立一条包括微波破碎、超滤、浓缩、离子交换层析、纳滤、大孔吸附层析、结晶的分离工艺路线,本工艺中离子交换层析的最佳工艺条件：流速1BV/h、平衡水用量8BV、洗脱剂为0.05M和0.15M盐酸溶液,总收率达到41.8%,GsH纯度达到95.3%以上,分离成本为738元/kg GsH,完成工艺中试放大。(2)建立一条包括酸热破碎、超滤、离子交换层析、脱色、纳滤、干燥的发酵生产sAM后提取工艺路线,将串联色谱柱用于离子交换层析工艺,最佳层析条件：上样sAM浓度10g/l、流速2BV/h、水洗体积4BV、洗脱方式为两根色谱柱串联洗脱,树脂吸附量可达到210g/l以上,是单柱的三倍。实验室小试总收率为65.5%,sAM纯度达到96%以上,西藏金稞集团完成工艺放大实验,总收率为50%,sAM纯度达到96%以上,分离成本为337元/kg sAM。(3)建立联产分离策略同时提取酿酒酵母胞内产物sAM和GsH,其中sAM收率达到65%以上,纯度达到96%以上,GsH收率达到38%,纯度达到95%以上,分离成本为345元/(1kg sAM+0.1kg GsH),比单独分离节省16%分离成本和GsH发酵成本。此外,利用碱法、碱酸法以及酶碱法来提取废弃酵母细胞菌泥中的p-葡聚糖,其中酶碱法提取效果最佳,收率达到80%以上,产品纯度达到90%以上。设计酵母综合利用工艺路线,提取sAM、GsH和p-葡聚糖,使酵母细胞得到充分利用。

关键词：谷胱甘肽 s-腺苷-l-甲硫氨酸 β-葡聚糖分离纯化

热水提取酿酒酵母中s-腺苷-l-甲硫氨酸的研究

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生物加工过程 2008年第1期6卷 74-77页

作者：姚进孝刘沛溢谭天伟北京化工大学生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室北京100029

研究了采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)北京,并且通过实验对影响sAM抽提的5个条件:抽提温度、抽提时间、热水用量、搅拌转速、硫酸用量等进行了优化。得出的最佳实验条件为:温度70℃、每30 g湿菌体加入热水10... 详细信息

研究了采用热水法直接提取酿酒酵母胞内产物s-腺苷-l-甲硫氨酸(sAM)北京,并且通过实验对影响sAM抽提的5个条件:抽提温度、抽提时间、热水用量、搅拌转速、硫酸用量等进行了优化。得出的最佳实验条件为:温度70℃、每30 g湿菌体加入热水100 ml、硫酸浓度0.25 mol/l、搅拌转速160 r/min,此时sAM的抽提率可达91.5%。与其他方法相比,该方法耗时少、仪器简单、抽提液中s-腺苷-l-甲硫氨酸质量浓度高、经济且无污染。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸提取酿酒酵母

高效液相色谱法分析胞内s-腺苷-l-甲硫氨酸含量及其合成酶活性的优化研究

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化学与生物工程 2011年第6期28卷 83-86,91页

作者：姚高峰秦秀林储炬钱江潮华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

对重组毕赤酵母胞内s-腺苷-l-甲硫氨酸（sAM）含量以及sAM合成酶活性的高效液相色谱（HPlC）测定方法进行了优化。通过调整流动相浓度和洗脱程序,建立了保留时间适中、分离效果好的sAM定量分析方法。结果表明,sAM浓度在0.05~0.5 g.l-1时... 详细信息

对重组毕赤酵母胞内s-腺苷-l-甲硫氨酸（sAM）含量以及sAM合成酶活性的高效液相色谱（HPlC）测定方法进行了优化。通过调整流动相浓度和洗脱程序,建立了保留时间适中、分离效果好的sAM定量分析方法。结果表明,sAM浓度在0.05~0.5 g.l-1时,其峰面积与浓度线性关系良好,相关系数为0.99996,平均回收率为99.3%~100.5%,相对标准偏差为0.72%~0.98%。该方法对胞内以及酶活测定液中的sAM能够进行有效分离,精密度高、稳定性好,能高效、准确地分析发酵过程菌体中sAM含量以及sAM合成酶活性。

关键词： s-腺苷-l-甲硫氨酸 s-腺苷-l-甲硫氨酸合成酶高效液相色谱

用一株乳克鳃维氏酵母突变株生产s—腺苷—l—甲硫氨酸

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中国医药工业杂志 2002年第12期33卷 592-592页

作者：龚家玮