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Accurate quantification of 3'-terminal 2'-O-methylated small RNAs by utilizing oxidative deep sequencing and stem-loop RT-qPCR

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Frontiers of Medicine 2022年第2期16卷 240-250页

作者： Yan Kong Huanhuan Hu Yangyang Shan Zhen Zhou Ke Zen Yulu Sun Rong Yang Zheng Fu Xi Chen Nanjing Drum Tower Hospital Center of Molecular Diagnostic and Therapy State Key Laboratory of Pharmaceutical BiotechnologyJiangsu Engineering Research Center for MicroRNA Biology and BiotechnologyNJU Advanced Institute of Life Sciences(NAILS)Institute of Artificial Intelligence BiomedicineSchool of Life SciencesNanjing UniversityNanjing 210023China Department of Urology Drum Tower HospitalMedical School of Nanjing UniversityInstitute of UrologyNanjing UniversityNanjing 210008China Department of General Surgery Drum Tower HospitalMedical school of Nanjing UniversityNanjing 210008China Research Unit of Extracellular RNA Chinese Academy of Medical SciencesNanjing 210023China

The continuing discoveries of novel classes of RNA modifications in various organisms have raised the need for improving sensitive,convenient,and reliable methods for quantifying RNA modifications.In particular,a subset of small RNAs,including microRNAs(miRNAs)and Piwi-interacting RNAs(piRNAs),are modified at their 3'-terminal nucleotides via 2'-0-methylation.However,quantifying the levels of these small RNAs is difficult because 2'-0-methylation at the RNA 3'-terminus inhibits the activity of polyadenylate polymerase and T4 RNA ligase.These two enzymes are indispensable for RNA labeling or ligation in conventional miRNA quantification assays.In this study,we profiled 3'-terminal 2'-0-methyl plant miRNAs in the livers of rice-fed mice by oxidative deep sequencing and detected increasing amounts of plant miRNAs with prolonged oxidation treatment.We further compared the efficiency of stem-loop and poly(A)-tailed RT-qPCR in quantifying plant miRNAs in animal tissues and identified stem-loop RT-qPCR as the only suitable approach.Likewise,stem-loop RT-qPCR was superior to poly(A)-tailed RT-qPCR in quantifying 3'-terminal 2'-0-methyl piRNAs in human seminal plasma.In summary,this study established a standard procedure for quantifying the levels of 3'-terminal 2'-0-methyl miRNAs in plants and piRNAs.Accurate measurement of the 3'-terminal 2'-0-methylation of small RNAs has profound implications for understanding their pathophysiologic roles in biological systems.

关键词： small RNAs 2'-0-methylation sequencing RT-qPCR

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用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

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四川农业大学学报 2023年第6期41卷 1107-1115页

作者：陈薪全潘宇恒敬云鸿牛丽莉甘麦邻赵叶陈蕾沈林園朱砺四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室成都611130 四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室成都611130

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPrt)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋... 详细信息

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPrt)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白(YWHAZ)、β-肌动蛋白(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)8个候选内参基因,选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪,进行三元杂交生产的商品猪(DLY),长白、约克猪进行二元杂交的商品猪(LY),成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性,但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因,该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。

关键词： RT-qPCR 候选内参基因基因表达稳定性骨骼肌猪

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桉蝙蛾幼虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

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环境昆虫学报 2023年第4期45卷 1016-1026页

作者：陈晓邱峙嵩苏小燕许原曹丽沙杨振德胡平广西大学林学院南宁530004

本研究通过筛选桉蝙蛾Endoclita signifer Walker幼虫不同龄期与不同体节中稳定表达的内参基因,为桉蝙蛾基因表达研究提供参考。通过实时荧光定量PCR技术测定5个候选内参基因(ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF)在桉蝙蛾幼虫不同龄期(3龄、5龄... 详细信息

本研究通过筛选桉蝙蛾Endoclita signifer Walker幼虫不同龄期与不同体节中稳定表达的内参基因,为桉蝙蛾基因表达研究提供参考。通过实时荧光定量PCR技术测定5个候选内参基因(ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF)在桉蝙蛾幼虫不同龄期(3龄、5龄、9龄、12龄)与不同体节(头部、胸部、腹部)及全样品(由所有样品组成)处理中的表达量,后利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper对5个候选基因的稳定性进行评估,最后由RefFinder综合分析结果,选出最佳的内参基因。基于4种分析方法的评估可知,桉蝙蛾5龄和9龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的头部和胸部中内参基因的最佳数目为2,而3龄和12龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的腹部及全样本中内参基因的最佳数目为3。3龄、5龄、9龄和12龄幼虫的不同体节中可分别选择ACTIN+RIB+GAPDH、EF+RIB、GAPDH+EF和ACTIN+RIB+GAPDH作为最稳定的内参基因组合;EF+RIB、RIB+GAPDH和EF+GAPDH+ACTIN可分别作为不同龄期幼虫头部、胸部和腹部的最佳内参基因组合;综合考虑桉蝙蛾幼虫不同龄期与不同体节的影响时,可选择RIB、ACTIN和GAPDH作为内参基因。

关键词：桉蝙蛾幼虫龄期体节内参基因 RT-qPCR

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斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选

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广西植物 2022年第2期42卷 340-348页

作者：宋美玲黄胜和陈祖杰邹嘉轩刘欢胜全文军江西中医药高等专科学校医学基础部江西抚州344000 南昌大学江西医学院南昌330031 南昌大学抚州医学院江西抚州344000

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选... 详细信息

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的前提条件之一是具有合适的内参基因。为筛选斑地锦(Euphorbia maculata)合适的RT-qPCR内参基因,该文利用同源克隆法克隆斑地锦GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP等基因片段,RT-qPCR检测7个候选内参基因在斑地锦不同生长期根、茎、叶和果实中的表达情况,并用geNorm、NormFinder和BestKeeper等生物学软件对各候选基因表达稳定性进行评价。结果表明:(1)克隆的GAPDH、EF-1α、act、UBQ、TUB-α、eIF-4A、CYP基因片段为729、808、753、422、233、656、313 bp,分别编码242、269、250、140、77、218、103个氨基酸,与其他植物相应氨基酸序列的最高同源性均在85%以上。(2)综合3个分析软件分析内参基因表达稳定性得出,表达稳定性排名为UBQ>EF-1α>TUB-α>eIF-4A>GAPDH>CYP>act。因此,可以选取UBQ作为斑地锦RT-qPCR分析的内参基因,用于不同生长期基因组织特异性表达研究。

关键词：斑地锦基因克隆内参基因 RT-qPCR

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Redesigned Duplex RT-qPCR for the Detection of GI and GII Human Noroviruses

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Engineering 2020年第4期6卷 442-448页

作者： Danlei Liu Zilei Zhang Qingping Wu Peng Tian Haoran Geng Ting Xu Dapeng Wang Department of Food Science and Technology School of Agriculture and BiologyShanghai Jiao Tong UniversityShanghai 200240China State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China&Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application&Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology&Guangdong Institute of Microbiology Guangzhou 510070China Produce Safety and Microbiology Research Unit Western Regional Research CenterAgricultural Research ServiceUnited States Department of AgricultureAlbanyCA 94706USA

Human noroviruses(HuNoVs)are major foodborne pathogens that cause nonbacterial acute gastroenteritis worldwide.As the tissue-culture system for HuNoVs is not mature enough for routine detection of the virus,detection is mainly dependent on molecular approaches such as reverse transcription polymerase chain reaction(rt-PCR)and reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction(rtqpcr).The widely used primers and probes for RT-qPCR were established in the early 2000s.As HuNoVs are highly variant viruses,viral genome mutations result in previously designed primers and/or probes that were perfectly matched working less efficiently over time.In this study,a new duplex RT-qPCR(ND-RT-qPCR)was designed for the detection of genogroup Ⅰ(GⅠ)and genogroup Ⅱ(GⅡ)HuNoVs based on an analysis of viral sequences added in the database after 2010.Using long transcribed viral RNAs,the results demonstrate that the sensitivity of ND-RT-qPCR is as low as one genomic copy for both GⅠ and GⅡ HuNoVs.The performance of ND-RT-qPCR was further evaluated by a comparison with the commonly used Kageyama primer/probe sets for RT-qPCR(Kageyama RT-qPCR)for 23 HuNoV-positive clinical samples.All five GⅠ samples were registered as positive by ND-RT-qPCR,whereas only two samples were registered as positive by Kageyama RT-qPCR.All 18 GⅡ samples were registered as positive by ND-RT-qPCR,while 17 samples were registered as positive by Kageyama RT-qPCR.The sensitivity reflected by the quantification cycle(Cq)value was lower in ND-RT-qPCR than in Kageyama RT-qPCR.Our data suggest that ND-RT-qPCR could be a good fit for the detection of current strains of HuNoVs.

关键词： Human noroviruses RT-qPCR Redesign Primer Probe Detection

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基于新冠病毒荧光检测的RT-qPCR温控系统

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电子测量技术 2022年第6期45卷 18-23页

作者：明焱冯汝鹏朴永杰民航机场规划设计研究总院有限公司西北分公司西安710000 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所长春130033

实时荧光定量聚合酶链式反应是新型冠状病毒COVID-19快速检测的重要手段,病毒样本经过一系列复杂的化学反应处理后通过RT-qPCR温控系统得到检测结果,RT-qPCR温控仪实际就是一台精准的测温、控温仪和光谱检测设备。采用ARM处理器+H桥驱动... 详细信息

实时荧光定量聚合酶链式反应是新型冠状病毒COVID-19快速检测的重要手段,病毒样本经过一系列复杂的化学反应处理后通过RT-qPCR温控系统得到检测结果,RT-qPCR温控仪实际就是一台精准的测温、控温仪和光谱检测设备。采用ARM处理器+H桥驱动器+帕尔贴的设计架构,通过归一化PID算法解决温度的快速升降问题,从而构建低成本、小型化的温控系统。该系统可以根据不同的温度设定和荧光剂选择适用其他病毒的核酸检测,整体控温指标可以达到升温速度不小于15℃/s、降温速度不小于8℃/s、温度精度0.1℃以内、升降温过冲小于4℃,稳定时间3 s。

关键词： RT-qPCR COVID-19 病毒样本 PID 温控系统核酸检测

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基于转录组测序和RT-qPCR技术的烟草糖酯合成基因挖掘

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轻工学报 2023年第6期38卷 78-84,117页

作者：黄申闫茗熠陈梦月尚紫博杨晨张金林褚智国毛多斌郑州轻工业大学烟草科学与工程学院河南郑州450001 山东中烟工业有限责任公司济南卷烟厂山东济南250000 山东中烟工业有限责任公司技术中心山东济南250000

为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个... 详细信息

为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个下调表达基因;上调表达基因主要包括生物学进程(2265个)、分子功能(1169个)、细胞成分(363个)3大类,可将基因序列定位到122条代谢通路中,其中与糖酯合成相关的糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成被高度富集,腺毛细胞中酰基糖通路显著上调,有12个基因在功能上与酰基转移酶有关;在腺毛细胞中,分析得到的12个基因中有11个基因的表达量都高于叶细胞,其中gene63826、gene16194和gene37511表达分别上调195.79倍、166.23倍和132.65倍。上述11个基因可能参与调控腺毛细胞合成糖酯,为下一步验证基因功能提供依据。

关键词：烟草糖酯腺毛细胞转录组差异表达基因 RT-qPCR

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糙皮侧耳热胁迫背景下RT-qPCR内参基因的筛选

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菌物研究 2023年第1期21卷 200-206页

作者：胡延如邵玉强陈浩澜戚元成王风芹文晴申进文河南农业大学生命科学学院郑州450002

通过文献报道和对糙皮侧耳基因组进行搜索,得到14个候选基因。以40℃热胁迫不同时间(0,1,2,4,8,12 h)的菌丝作为材料,通过反转录得到的候选基因片段,进行实时荧光定量PCR筛选,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件对结果进行分析... 详细信息

通过文献报道和对糙皮侧耳基因组进行搜索,得到14个候选基因。以40℃热胁迫不同时间(0,1,2,4,8,12 h)的菌丝作为材料,通过反转录得到的候选基因片段,进行实时荧光定量PCR筛选,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件对结果进行分析,筛选得到稳定的内参基因β肌动蛋白(β-actin)、假定蛋白(sar1)。此外,选取2种热应激反应基因Hsp9、Hsp90作为靶基因,分别以筛选得到的稳定、不稳定基因以及多个内参基因作为内参进行分析,结果显示选用多个内参基因时能够缩小不同基因作为内参导致的结果差异。

关键词：食用菌热胁迫内参基因 RT-qPCR

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一种快速简便的伪狂犬病病毒EP0基因RT-qPCR检测方法的构建

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中国动物传染病学报 2022年第4期30卷 81-86页

作者：张丽荣阮可悦童武李国新高飞单同领于海童光志郑浩中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

伪狂犬病病毒EP0基因编码区与病毒长的潜伏相关转录物(LLT)互补,这干扰了EP0基因表达的定量分析。本研究根据新近证实的EP0剪接体的序列,设计合成一对特异性引物,以GAPDH作为内参,建立一种SYBR Green实时荧光定量PCR检测EP0表达。提取PR... 详细信息

伪狂犬病病毒EP0基因编码区与病毒长的潜伏相关转录物(LLT)互补,这干扰了EP0基因表达的定量分析。本研究根据新近证实的EP0剪接体的序列,设计合成一对特异性引物,以GAPDH作为内参,建立一种SYBR Green实时荧光定量PCR检测EP0表达。提取PRV感染细胞的总RNA,分析了DNaseⅠ消化处理、不同反转录引物对检测结果的影响,并且利用该方法检测了EP0基因在感染细胞中的表达特征。结果显示:建立的RT-qPCR溶解曲线单一,且重复性好;PRV基因组DNA不影响RT-qPCR的检测,总RNA不经过DNaseⅠ消化可直接用于EP0的表达检测;随机引物比Oligo(dT)更适合用于反转录,能获得更灵敏的EP0检测结果;EP0基因在感染细胞8 h后表达量达到最高。小鼠三叉神经组织EP0定量检测发现LLT启动子缺失病毒与亲本病毒相比表达量明显降低。上述结果显示,本文成功建立了检测伪狂犬病病毒EP0基因快速简便的方法,为EP0基因的研究提供了有力手段。

关键词：伪狂犬病病毒 EP0基因 RT-qPCR

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桔梗不同花色实时定量PCR内参基因的筛选及验证

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分子植物育种 2022年

作者：马璐琳段青王祥宁杜文文贾文杰李想崔光芬王继华云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，国家观赏园艺工程技术研究中心，云南省种子种业联合实验室

为了筛选适用于桔梗类黄酮/花青素苷合成途径基因表达情况RT-qPCR分析所需的内参基因，本研究根据已完成的桔梗蓝、紫、白等3种花色花器官的转录组测序结果，选取了水通道蛋白基因(aquaporin， AQP)、微管蛋白基因(α-tubulin， α-TUB... 详细信息

为了筛选适用于桔梗类黄酮/花青素苷合成途径基因表达情况RT-qPCR分析所需的内参基因，本研究根据已完成的桔梗蓝、紫、白等3种花色花器官的转录组测序结果，选取了水通道蛋白基因(aquaporin， AQP)、微管蛋白基因(α-tubulin， α-TUB)、肌动蛋白基因(β-actin， β-ACT)、磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)、亲环蛋白基因(cyclophilin， CYP)、转录延伸因子基因(elongation factor 1-α， EF-1α)、组蛋白基因(histone， HIS)、60S核糖体蛋白基因(60S ribosomal protein L13-1， RPL13)和多聚泛素酶基因(polyubiquitin， UBQ)等9个常用看家基因作为候选内参基因，利用RT-qPCR对候选内参基因在桔梗不同组织器官中的表达情况进行检测分析，通过NormFinder、geNorm和BestKeeper等3个不同软件比较评价它们的表达稳定性。最终从9个候选内参基因中筛选出表达最稳定的内参基因为RPL13，以RPL13作为内参基因对桔梗类黄酮/花青素苷合成途径部分基因的表达情况进行RT-qPCR分析结果与转录组测序结果相吻合。因此RPL13为最适合于桔梗类黄酮/花青素苷合成途径中相关基因表达分析时的内参基因。本研究为桔梗花色素合成途径基因表达分析提供了合适的内参基因。

关键词：桔梗内参基因 RT-qPCR 基因表达类黄酮/花青素苷合成途径

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