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稳定表达兔岩藻糖基转移酶rk13细胞系的建立

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中国动物传染病学报 2015年第2期23卷 1-6页

作者：朱杰缪秋红郭慧敏谭永贵李传峰孟春春陈宗艳刘光清中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为了构建稳定表达兔岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT2)的rk13细胞系,本研究将FUT2基因编码序列插入到慢病毒载体p LOV-GFP-3Flag中,构建了p LOV-3Flag-FUT2重组质粒。将p LOV-3Flag-FUT2与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染293T细胞,获得重组病毒样颗粒。用含病毒样颗粒的细胞培养上清液感染rk13细胞,并通过嘌呤霉素筛选、纯化,获得稳定表达FUT2的细胞系,命名为rk-FUT2细胞。连续培养10代后,利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鉴定,结果表明,rk-FUT2细胞系能够稳定表达兔岩藻糖基转移酶。该细胞系为研究FUT2在兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染过程和致病机制中的作用提供了有力工具。

关键词：兔岩藻糖基转移酶 rk13细胞兔病毒性出血症病毒

稳定表达LamR的rk13细胞系的建立及RHDV吸附能力的初步研究

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畜牧与兽医 2018年第8期50卷 44-48页

作者：黄萍宋艳华胡波魏后军范志宇仇汝龙陈萌萌薛家宾王芳 JUNG Yong-Sam 南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210014

为建立稳定表达层黏连蛋白受体（LamR）rk13细胞系（rk13-LamR）,并研究LamR蛋白在兔出血症病毒（RHDV）与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与... 详细信息

为建立稳定表达层黏连蛋白受体（LamR）rk13细胞系（rk13-LamR）,并研究LamR蛋白在兔出血症病毒（RHDV）与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染rk13细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达LamR蛋白的rk13细胞。通过间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting证明所获细胞株能够稳定表达LamR蛋白,将细胞株命名为rk13-LamR。以纯化的RHDV接种rk13-LamR细胞,IFA检测结果显示,LamR蛋白能促进RHDV对rk13细胞的吸附。本研究建立了RHDV相对敏感的细胞株,证实在RHDV吸附宿主细胞的过程中,LamR蛋白起到一定的作用。

关键词：慢病毒载体 Lam R rk13细胞兔出血症病毒

稳定表达LamR的rk13细胞系的建立及RHDV感染性的初步研究

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稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV感染性的初步研究

利用反向遗传学技术获得适应rk13细胞的兔出血症病毒

中国畜牧兽医学会养兔学分会第二届学术交流大会

作者：黄萍胡波宋艳华范志宇魏后军仇汝龙薛家宾王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培... 详细信息

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培养,极大阻碍了对该病毒致病机制的深入研究。病毒受体是病毒侵入宿主细胞的主要门户,病毒与宿主细胞上的受体特异性结合后侵入细胞,进而组装释放新的病毒颗粒感染其他细胞得以增殖。受体研究可揭示病毒与宿主之间的作用机制,因此成为研究者关注的焦点。本实验室前期研究结果显示RHDV农壳蛋白VP60 P2亚区的高变区与层黏连蛋白受体(LamR)蛋白存在直接的相互作用,提示LamR蛋白在病毒吸附入侵宿主细胞过程中可能发挥着重要作用。本研究目的为了探究LamR对RHDV吸附与入侵等的影响,本实验首先将完整的LamR序列通过同源重组法克隆入慢病毒表达质粒pLVX-mCherry-N1。将该质粒与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLp-VSV/G共转染到293T细胞,包装成含LamR基因的重组慢病毒。将收获的慢病毒在Polybrene的介导下感染rkl3细胞,采用嘌呤霉素筛选筛选出l株能稳定表达的细胞系,命名为rkl3-LamR。经免疫荧光和Western blotting检测,结果显示该细胞株能够稳定表达LamR蛋白,成功构建了稳定表达LamR蛋白的rk13细胞系。另外,为研究RHDV对rk13-LamR的感染性,本实验用RHDV接种正常rkl3细胞与rkl3-LamR细胞系,采用间接免疫荧光法检测RHDV对细胞的吸附作用;通过对RHDV接种量的优化,选择合适的病毒量接种rkl3细胞和rkl3-LamR细胞,并收集接种RHDV后不同时间点的细胞样品,采用血凝试验(HA)测定病毒的HA效价;通过qRT-PCR反应,进一步检测RHDV在rkl3-LamR细胞中的复制情况。结果表明,LamR蛋白可以促进RHDV对rk13细胞的吸附,但并未检测到病毒在细胞内的复制和增殖,说明层粘连蛋白可能是RHDV感染肝细胞过程中的一个受体,这为进一步研究RHDV对肝细胞的入侵及RHDV的致病机理提供了重要的线索。

关键词： RHDV 慢病毒载体 LamR rk13细胞吸附

来源： cnki会议评论

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利用反向遗传学技术获得适应RK13细胞的兔出血症病毒

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议...

作者：刘光清倪征云涛张玉颖盛祖恬浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所农业部病毒学与生物技术重点实验室

本研究在前期构建的兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic diseasc virus,RHDV)全长cDNA分子的基础上,利用SP6RNA聚合酶系统,在体外转录合成了病毒RNA．然后用转染试剂将病毒RNA导入rk13 细胞,12h后可见明显致细胞病变(CPE),用问接免疫荧光... 详细信息

本研究在前期构建的兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic diseasc virus,RHDV)全长cDNA分子的基础上,利用SP6RNA聚合酶系统,在体外转录合成了病毒RNA．然后用转染试剂将病毒RNA导入rk13 细胞,12h后可见明显致细胞病变(CPE),用问接免疫荧光方法在rkl3细胞中也检测到了病毒抗原的产生。将收获的细胞培养物再次接种rkl3细胞,仍然能产生明显病变,其半数组织感染量(TCID50)可达 104．6／ml.最后大量收取细胞培养物,经差速离心法纯化病毒后,在电镜下可观察到RHD病毒粒子．上述实验结果证明我们利用反向遗传学技术首次获得了可适应于rk13培养的RHDV,为将来研究RHDV的分子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具。

关键词：兔出血症病毒反向遗传学全长cDNA rk13细胞

来源： cnki会议评论

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兔出血症病毒在体外诱导细胞凋亡

病毒学报 2009年第4期25卷 316-317页

作者：倪征魏威刘光清陈柳余斌云涛华炯钢李双茂浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所浙江杭州310021 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

The apoptosis of rk13 cells induced by RHDV was investigated with DAPI staining,DNA ladder,Caspase 3 activity and flow cytometry,*** results showed that nuclear staining of infected cells with DAPI showed gradually morphological changes of the *** shown in the paper,a canonic oligonucleosome-sized DNA ladder was observed in cells harvested at 24h,48h and 72h post-infection,confirming that DNA fragmentation was induced by RHDV *** results of flow cytometry showed that about 63 % of cells were in apoptosis at 48h ***,we also demonstrated that the activation of Caspase 3 occurred during the infection *** conclusion,our results showed that apoptosis in RHD might be determinant in the development of the pathogenesis of RHD.

关键词：兔出血症病毒 rk13细胞凋亡 Caspase-3

Rescued virus from infectious cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus is adapted to rk13 cells line

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Chinese Science Bulletin 2006年第14期51卷 1698-1702页

作者： LIU Guangqing NI Zheng YUN Tao ZHANG Yuying DU Qingyun SHENG Zutian LIANG Huali HUA Jionggang LI Shuangmao Chen Jianping Key Laboratory of Virology & Biotechnology of Agriculture Ministry Zhejiang Academy of Agriculture Sciences Hangzhou 310021 China Animal Veterinary Medicine College Gansu Agricultural UniversitylLanzhou 730070 China

Based on the infectious full-length cDNA clone of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), the in vitro transcripts are introduced into rk13 cells. 12 h later, CPE could be observed clearly, and virual antigen could also be detected by IFA. The titre of the recovered virus is 104.6/mL. Immune electron micro-scopic observation of the virus particles revealed that the particles were rotund with a diameter of about 30 nm. Besides, virus titre quantification obtained by qRT-PCR showed a correlation between time from infection and virus titre. All these results showed that we have recovered RHDV from rk13 cells by re-verse genetics technology successfully, and this would be very useful in studies of the antigenicity, virulence, pathogenesis, maturation and new type vaccines of RHDV.

关键词：兔出血性疾病 RHDV 反求遗传学 rk13细胞 cDNA