稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV感染性的初步研究
作者单位：江苏省农业科学院兽医研究所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心
会议名称：《中国畜牧兽医学会养兔学分会第二届学术交流大会》
会议日期：2018年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
基 金：现代农业产业技术体系建设-兔体系病毒病预防与控制岗位项目(CARS-43-C-1) 中国博士后科学基金面上资助(2017M611754) 国家自然科学基金青年科学基金项目(No.31702274)
关 键 词：RHDV 慢病毒载体 LamR RK13细胞 吸附
摘 要：兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性病毒性传染病,具有高发病率和高死亡率等特征,给我国乃至世界养兔业造成了重大威胁。一直以来RHDV难以在体外培养,极大阻碍了对该病毒致病机制的深入研究。病毒受体是病毒侵入宿主细胞的主要门户,病毒与宿主细胞上的受体特异性结合后侵入细胞,进而组装释放新的病毒颗粒感染其他细胞得以增殖。受体研究可揭示病毒与宿主之间的作用机制,因此成为研究者关注的焦点。本实验室前期研究结果显示RHDV农壳蛋白VP60 P2亚区的高变区与层黏连蛋白受体(LamR)蛋白存在直接的相互作用,提示LamR蛋白在病毒吸附入侵宿主细胞过程中可能发挥着重要作用。本研究目的为了探究LamR对RHDV吸附与入侵等的影响,本实验首先将完整的LamR序列通过同源重组法克隆入慢病毒表达质粒pLVX-mCherry-N1。将该质粒与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和pLp-VSV/G共转染到293T细胞,包装成含LamR基因的重组慢病毒。将收获的慢病毒在Polybrene的介导下感染RKl3细胞,采用嘌呤霉素筛选筛选出l株能稳定表达的细胞系,命名为RKl3-LamR。经免疫荧光和Western blotting检测,结果显示该细胞株能够稳定表达LamR蛋白,成功构建了稳定表达LamR蛋白的RK13细胞系。另外,为研究RHDV对RK13-LamR的感染性,本实验用RHDV接种正常RKl3细胞与RKl3-LamR细胞系,采用间接免疫荧光法检测RHDV对细胞的吸附作用;通过对RHDV接种量的优化,选择合适的病毒量接种RKl3细胞和RKl3-LamR细胞,并收集接种RHDV后不同时间点的细胞样品,采用血凝试验(HA)测定病毒的HA效价;通过qRT-PCR反应,进一步检测RHDV在RKl3-LamR细胞中的复制情况。结果表明,LamR蛋白可以促进RHDV对RK13细胞的吸附,但并未检测到病毒在细胞内的复制和增殖,说明层粘连蛋白可能是RHDV感染肝细胞过程中的一个受体,这为进一步研究RHDV对肝细胞的入侵及RHDV的致病机理提供了重要的线索。