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拟南芥锚蛋白ANK6和SIG5的相互作用研究

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拟南芥锚蛋白ANK6和SIG5的相互作用研究

作者：史佳湖南师范大学

学位级别：硕士

锚蛋白含有由锚蛋白重复模体组成的锚蛋白重复结构域,能介导蛋白质与蛋白质的相互作用,实现纷繁复杂的生物功能。在拟南芥中,至少有108个锚蛋白基因。实验室的前期工作证明锚蛋白基因家族的一个成员,ANK6,在植物受精过程中起重要作用。... 详细信息

锚蛋白含有由锚蛋白重复模体组成的锚蛋白重复结构域,能介导蛋白质与蛋白质的相互作用,实现纷繁复杂的生物功能。在拟南芥中,至少有108个锚蛋白基因。实验室的前期工作证明锚蛋白基因家族的一个成员,ANK6,在植物受精过程中起重要作用。把ANK6作为“饵”蛋白,利用酵母双杂交的方法筛选拟南芥cDNA文库,筛选到一些与ANK6蛋白相互作用的候选蛋白,SIG5是其中之一。本研究用实验证实SIG5与ANK6确实存在互作,研究结果如下：分别构建好ANK6和SIG5的酵母双杂载体,共同转入AH109酵母菌株,利用酵母双杂交系统证实ANK6和SIG5的全长在酵母细胞中发生相互作用。构建六个SIG5分段缺失突变体,把它们分别与ANK6放入酵母双杂系统中验证,发现ANK6是与SIG5的N端发生了相互作用。为了进一步证明ANK6蛋白和SIG5蛋白的相互作用这一结果,构建ANK6-GST和SIG5-His6融合蛋白,并把它们在原核系统中表达,分离该两种可溶的重组蛋白,然后进行pull-down实验,用Western-blot验证目的蛋白的存在。pull-down实验的结果也证实了ANK6蛋白和SIG5蛋白确实发生了相互作用。 SIG5和ANK6的突变体都筛选不到纯合体,且其杂合突变体果荚中存在空座位现象。构建SIG5-GUS融合基因,将融合基因通过花浸法转化得到GUS转基因植物。从GUS化学组织染色可以看出,SIG5的转基因植物有空间上的特异性,主要是在花粉,胚珠,叶中有特异的表达,这也与ANK6相似。综上所述,本研究主要对拟南芥ANK家族中的成员ANK6进行了蛋白相互作用的分析。通过酵母双杂交和pull-down实验发现并验证了ANK6蛋白和SIG5蛋白发生相互作用,SIG5基因的突变体和ANK6基因的突变体有着极为相似的表型,并且表达模式上也极为相似。这为更好的研究ANK6基因在拟南芥生长发育过程中的生理功能奠定了基础。

关键词：拟南芥锚定重复序列酵母双杂交系统 pull-down 表达模式

鱼类TLR5与病原配体的识别和信号传导机制研究

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鱼类TLR5与病原配体的识别和信号传导机制研究

作者：孙晴宇河南师范大学

学位级别：硕士

Toll样受体是一类非常重要的模式识别受体,能够识别病原相关分子模式,引发免疫反应。泥鳅是我国以及亚洲沿岸各国重要的养殖鱼类,受高密度养殖和水质恶化影响,由细菌、病毒和寄生虫感染引起的病害给鱼类养殖业造成了巨大损失。嗜水气单... 详细信息

Toll样受体是一类非常重要的模式识别受体,能够识别病原相关分子模式,引发免疫反应。泥鳅是我国以及亚洲沿岸各国重要的养殖鱼类,受高密度养殖和水质恶化影响,由细菌、病毒和寄生虫感染引起的病害给鱼类养殖业造成了巨大损失。嗜水气单胞菌作为淡水鱼类传染病诱因之一,会引发泥鳅的败血症甚至死亡。目前泥鳅被嗜水气单胞菌感染后的研究主要集中于生化指标和免疫指标的检测,对致病菌影响鱼类生殖发育缺少系统研究。本实验以泥鳅为研究对象,利用三代测序技术构建了泥鳅不同发育时期性腺(原始生殖腺、已分化尚未成熟的雌雄性腺、成熟非繁殖期雌雄性腺和成熟繁殖期性腺)的转录组文库,通过分析筛选出了与泥鳅性腺发育相关的TLR基因。利用PCR技术扩增了泥鳅TLR5基因和MyD88基因,展开对其序列结构特征、在正常组织中表达以及免疫应答规律的研究。主要获得以下成果:1、TLR5和MyD88的cDNA全长分别是1785 bp和855 bp,推定编码594个、284个氨基酸。蛋白结构分析显示,TLR5具有一个信号肽、九个富含亮氨酸的重复结构域(LRR)、一个富含亮氨酸的重复C末端结构域(LRR-CT),三个富含亮氨酸的重复典型的亚家族结构域(LRR-TYP),跨膜结构域和细胞内Toll/白细胞介素-1受体结构域(TIR);MyD88具有一个死亡结构域和一个TIR结构域。序列分析和进化分析证实,泥鳅TLR5和MyD88序列具有保守性,且均与鲤形目鱼类聚为一大支。2、qPCR检测健康泥鳅TLR5基因的表达分布。结果表明,TLR5在所检组织(脑、鳃、皮肤、肠道、心脏、肾脏、肝脏和性腺)中呈组成型分布且具有性别二态性,在肠道表达量最高,鳃、肾脏和卵巢次之,在心脏中表达最低,这表明TLR5参与了机体各种生命活动。同时我们检测在不同发育时期的泥鳅性腺中不同TLR基因的表达,结果表明在卵巢中TLR5呈现高表达,在精巢中TLR5的表达要低于TLR9和TLR21。在不同发育时期的卵巢中TLR5的表达显著高于精巢。3、嗜水气单胞菌刺激后,在成熟性腺和二期性腺中TLR5以及TLR通路相关基因MyD88、TRAF6、TAK1、AP1、P50均发生了显著性的上调,而上调的TLR信号通路关键基因又可通过NF-κB信号通路和MAPK途径来促进细胞因子(IL-1β,IL-12,TNF-α)的分泌,导致泥鳅性腺中的炎症反应增加。以上结果提示TLR5在性腺组织的抗细菌感染过程中发挥着重要的免疫作用。4、为进一步了解TLR5识别病原体的分子机制,并鉴定不同的LRR结构域的功能,使用p ET30a原核表达系统,构建TLR5胞外结构域(p ET30a-TLR5-1和p ET30aTLR5-2)重组蛋白。通过细菌结合实验和糖结合实验,发现p ET30a-TLR5-1和p ET30a-TLR5-2蛋白能够识别并结合多种细菌,并高饱和的识别脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)。5、为了鉴定TLR5激活TLR信号通路的机制,构建p ET30a-MyD88和p GExTLR5-TIR原核重组质粒,利用pull-down技术,探究MaTLR5与MaMyD88蛋白互作关系。结果显示,MaTLR5能与MaMyD88相互作用,表明TLR5可以通过识别MyD88激活TLR通路引发免疫反应。

关键词：泥鳅 TLR5 细菌结合糖结合 pull-down

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)p8蛋白与寄主水稻因子OsGID1的互作研究

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水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)p8蛋白与寄主水稻因子OsGID1的互作研究

作者：刘晓雅浙江师范大学

学位级别：硕士

植物病毒是细胞内病原体,仅编码少量的病毒蛋白,必须利用宿主因子来完成其生命周期。病毒蛋白,如外壳蛋白、复制相关蛋白、运动蛋白、病毒沉默抑制子等,常通过与寄主因子相互作用参与病毒的增殖、运动、传播,并可能诱发寄主植物发育异... 详细信息

植物病毒是细胞内病原体,仅编码少量的病毒蛋白,必须利用宿主因子来完成其生命周期。病毒蛋白,如外壳蛋白、复制相关蛋白、运动蛋白、病毒沉默抑制子等,常通过与寄主因子相互作用参与病毒的增殖、运动、传播,并可能诱发寄主植物发育异常、黄化、坏死等一系列症状。因此,揭示病毒蛋白与寄主因子的相互作用有助于了解病毒致病机制、发展病毒防控新策略。水稻黑条矮缩病的病原是水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)。该病毒是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个确定成员,由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus)传播。感染了RBSDV的水稻植株多表现出植株矮缩、分蘖增多、叶色浓绿和沿叶脉出现瘤状突起等明显的症状。RBSDV基因组由10条双链RNA (dsRNA)组成,分别命名为S1-S10,水稻全基因组序列的测定已完成,其中基因组S8编码的蛋白质p8是病毒粒子的核心结构蛋白,并存在一个保守的NTP结合域。但RBSDV p8与寄主水稻因子之间的互作尚不清楚。本研究首先以RBSDV p8为诱饵,利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库,共获得3个可能与p8互作的寄主因子。其中1个潜在互作因子,即赤霉素不敏感矮缩蛋白1(Gibberellin-insensitive dwarf protein 1, OsGED1)全长编码区被克隆并用于进一步的研究。酵母双杂交、BiFC和pull-down试验结果一致表明RBSDV p8与OsGID1之间在体内外均存在强烈的相互作用。亚细胞定位试验表明RBSDV p8和寄主因子OsGID1可以分别单独定位于烟草表皮细胞的细胞质和细胞核中。同时,RBSDV p8和OsGID1还可以在烟草表皮细胞的细胞质和细胞核中共定位,这进一步证明了RBSDV p8和OsGID1之间的互作关系。进一步通过酵母双杂交试验分析表明RBSDV p8和OsGID1互作的关键结构域位于p8的339-489aa区域。此外,通过花序浸润法将RBSDV p8遗传转化拟南芥,成功获得50株T1代转p8基因拟南芥。观察转基因拟南芥的表型与空白对照和野生型进行对比,发现转基因拟南芥出现了明显的矮缩症状。基于以上研究结果,我们推测RBSDV p8与OsGID1的互作可能影响寄主水稻体内的赤霉素信号转导途径,从而引起植株矮缩。

关键词：蛋白互作 RBSDV OSGID1 酵母双杂交荧光双分子互补 pull-down

斜纹夜蛾细胞Spli Apaf-1蛋白在细胞凋亡过程中作用机制的初步研究

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斜纹夜蛾细胞Spli Apaf-1蛋白在细胞凋亡过程中作用机制的初步研究

作者：赵婧妍华中师范大学

学位级别：硕士

细胞凋亡通路的研究受到科学工作者的广泛关注,并且取得了众多成果。目前研究的较为透彻的是在线虫、果蝇和人类中的细胞凋亡通路,由于细胞凋亡事件在进化过程中的保守性,它们存在着许多相似的地方,但也有许多进化上的分歧引发的不同。... 详细信息

细胞凋亡通路的研究受到科学工作者的广泛关注,并且取得了众多成果。目前研究的较为透彻的是在线虫、果蝇和人类中的细胞凋亡通路,由于细胞凋亡事件在进化过程中的保守性,它们存在着许多相似的地方,但也有许多进化上的分歧引发的不同。最具保守性的是内源性线粒体凋亡通路,以哺乳动物为例,当细胞发生凋亡时,细胞色素C从线粒体的内外膜间质释放到细胞质中,跟位于细胞质中的Apaf-1结合引起其聚合形成凋亡体复合物,继而募集起始Caspase9酶原并活化形成一个大型的蛋白水解机器,切割活化效应Caspase引起凋亡的级联反应。然而在对鳞翅目昆虫凋亡通路的研究中却发现了与进化上相近的果蝇凋亡通路中相左事件,即内源性通路起始因子细胞色素C在该通路中是否参与的问题。凋亡体复合物是内源性线粒体通路的中心,而其组装亚单位Apaf-1更是该通路的核心蛋白,对鳞翅目昆虫Apaf-1的研究将为进一步揭示昆虫细胞凋亡通路的分子机制提供条件。本研究首先制备了斜纹夜蛾细胞Apaf-1蛋白的多克隆抗体,并运用该抗体对Apaf-1蛋白的功能进行初步研究。根据本实验室获得的斜纹夜蛾Apaf-1SNP序列,选取其中一段编码147个氨基酸的保守序列作为目的片段,构建原核表达载体pET22b-Apaf1N147,表达并纯化融合蛋白His-Apaf1N147,免疫兔子制备多克隆抗血清,然后以亲和层析的方法纯化所获得的抗血清并通过Western blot检测。结果表明,制备并纯化后的抗体可以特异性结合原核表达的Apaf-1抗原蛋白和斜纹夜蛾内源的Apaf-1蛋白。斜纹夜蛾Apaf-1兔多克隆抗体的制备,为进一步研究鳞翅目昆虫Apaf-1蛋白的结构和功能提供了有力的条件;同时,我们也提出了一个快速高效纯化多克隆抗体的方案。通过免疫荧光,我们利用所制备的Apaf-1兔多克隆抗体以及带有FITC标签的荧光二抗,以BSA作为对照间接地鉴定了这个蛋白在斜纹夜蛾细胞中的定位,结果显示它定位在胞质中。为了更进一步研究Apaf-1蛋白在鳞翅目昆虫凋亡通路中的作用,需要将该蛋白的ORF正确地扩增出来并外源表达。我们通过改变扩增体系中Mg2+浓度和退火温度以高保真KOD酶最终经过双轮PCR获得了Apaf-1的ORF全长,将其连接到原核表达载体上进行原核表达尝试,结果未获得完整正确表达的Apaf-1蛋白。之后我们构建真核表达载体pIE1-Apaf-1-EGFP并将构建好的真核表达载体转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞中,并在荧光显微镜下观察,结果发现外源的融合蛋白Apaf-1-GFP在斜纹夜蛾细胞中得以表达并且表达了的融合蛋白定位在细胞质当中,这与免疫荧光实验的结果相一致。用免疫共沉淀技术通过抗原抗体之间相互作用以及Protein G与抗体IgG之间特异的相互作用将斜纹夜蛾胞质蛋白中能够与Cyto C相互作用的Apaf-1蛋白沉淀下来并通过western blot检测;用pull-down技术通过挂在Ni-NTA树脂上的原核表达的融合蛋白His-Cyto C将斜纹夜蛾胞质蛋白中能与细胞色素C相互作用的Apaf-1蛋白留滞在Ni-NTA树脂上,然后通过western blot检测,结果发现在斜纹夜蛾细胞凋亡的线粒体内源性通路中存在Apaf-1蛋白和Cyto C之间的相互作用。之后我们构建了真核表达载体pIEl-EGFP-Cyto C和pIE2-Apaf-1-Cherry,然后将它们同时转染进处于对数生长期的斜纹夜蛾细胞并在激光共聚焦显微镜下观察,结果显示转染后细胞发生凋亡并且红色代表的Apaf-1蛋白和绿色代表的Cyto C蛋白存在基本的共定位现象。这些实验结果进一步肯定了在鳞翅目昆虫斜纹夜蛾中存在类似哺乳动物的内源性线粒体通路。 Apaf-1多克隆抗体的制备,ORF的克隆以及与细胞色素C之间相互作用的研究都为鳞翅目昆虫细胞凋亡通路分子机制的阐明奠定了基础。

关键词：斜纹夜蛾细胞凋亡 Apaf-1 免疫共沉淀 pull-down 细胞色素C

鸡柔嫩艾美尔球虫SERPIN1宿主互作蛋白的筛选鉴定及功能初步研究

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鸡柔嫩艾美尔球虫SERPIN1宿主互作蛋白的筛选鉴定及功能初步研究

作者：姜盈盈山东农业大学

学位级别：硕士

鸡艾美尔球虫可侵害鸡的肠道,其中鸡柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)对鸡肠道造成的危害最大,其特征是扰乱肠道摄取营养导致机体体重下降甚至死亡,给鸡养殖业造成了沉重负担。鸡球虫子孢子入侵肠上皮细胞是球虫感染的前提,因此,了解球... 详细信息

鸡艾美尔球虫可侵害鸡的肠道,其中鸡柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)对鸡肠道造成的危害最大,其特征是扰乱肠道摄取营养导致机体体重下降甚至死亡,给鸡养殖业造成了沉重负担。鸡球虫子孢子入侵肠上皮细胞是球虫感染的前提,因此,了解球虫的入侵机制可为开发新的抗鸡球虫防控策略提供理论依据。课题组前期研究发现丝氨酸蛋白酶抑制蛋白1(EtSERPIN1)在子孢子入侵DF-1细胞过程中显著上调,EtSERPIN1的单因子血清能够显著抑制柔嫩艾美尔球虫子孢子入侵DF-1细胞的能力,提示该蛋白参与虫体的入侵过程。因此,鉴定EtSERPIN1与宿主蛋白的互作网络,可为探究EtSERPIN1参与虫体入侵的分子基础提供参考,为挖掘抗鸡球虫的潜在靶点提供理论依据。本研究拟筛选鉴定与EtSERPIN1互作的宿主蛋白,并探究EtSERPIN1蛋白是否有组织嗜性及其膜受体的功能,为进一步开展调控入侵机制研究提供方向。本研究主要分以下三个部分:***1基因的扩增、蛋白表达、多抗的制备及鉴定本研究中,首先提取***的cDNA,以其为模板,扩增EtSERPIN1基因片段,将EtSERPIN1基因片段与酶切后的空载体pEGFP-C1相连,构建pEGFP-SERPIN1重组质粒。并将此质粒转染到DF-1细胞(密度为70%),进行融合蛋白的真核表达。多克隆抗体由本实验室提供。用子孢子全蛋白验证多抗,结果显示多抗可孵育出EtSERPIN1大小的单一条带。2.筛选鉴定与EtSERPIN1互作的宿主蛋白及进一步探究MAPK1的功能本研究通过GFP pull-down方法筛选出与EtSERPIN1蛋白互作的宿主蛋白并进行质谱分析。分析结果表明,66个宿主蛋白可能与EtSERPIN1存在相互作用。蛋白大小不符合的52个。匹配率不合格的蛋白2个。蛋白大小符合的12个(6个蛋白定位在细胞质、6个蛋白定位在细胞膜)。通过分析,本研究选取5(4个膜蛋白1个通路蛋白)个得分较高的蛋白(ANXA1、ANXA2、ANXA5、ANXA13、MAPK1)应用酵母双杂系统、GST pull-down技术进行互作验证。结果表明EtSERPIN1蛋白与盲肠蛋白ANXA2、MAPK1存在相互作用。当EtSERPIN1蛋白在DF-1细胞过表达后,本研究通过qPCR检测DF-1细胞的MAPK1转录水平下降,柔嫩艾美尔球虫感染雏鸡后,鸡盲肠MAPK1转录水平上升。***2(膜联蛋白II)在球虫入侵及组织嗜性中的作用为了进一步探索ANXA2在球虫入侵及组织嗜性中的作用,本研究设计了抗体阻断试验、免疫组化试验、相对荧光定量qPCR研究方法。体外抗体阻断试验结果表明,抗EtSERPIN1抗体单向阻断可降低入侵DF-1细胞的子孢子的数量,最高抑制率为37%±1.41%,抗ANXA2抗体单向阻断可降低入侵DF-1细胞的子孢子的数量,最高抑制率为37.15%±1.06%,抗EtSERPIN1抗体与抗ANXA2抗体双向阻断可降低入侵DF-1细胞的子孢子的数量,最高抑制率为46.5%±2.12%。免疫组化结果表明EtSERPIN1蛋白与十二指肠、空肠、回肠有较弱的结合力,与盲肠结合力较强,与各个肠段结合后的平均荧光强度比值分别为:0.62%、2.56%、12.17%、17.46%。用抗ANXA2抗体对盲肠进行封闭处理,发现EtSERPIN1蛋白与盲肠的结合能力下降进一步表明ANXA2可能为EtSERPIN1的膜受体。qPCR结果表明柔嫩艾美尔球虫感染盲肠12 h、24 h后ANXA2的转录水平明显高于其他三个肠段从而推测12 h、24 h处于入侵阶段,且在组织嗜性中起重要作用。本研究筛选并验证了EtSERPIN1蛋白与ANXA2、MAPK1存在相互作用。ANXA2为互作的宿主膜受体,对雏鸡具有部分免疫保护力,在球虫入侵及组织嗜性中起重要作用。

关键词：柔嫩艾美尔球虫 EtSERPIN1 酵母双杂交系统 pull-down ANXA2

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柽柳ThTrx5基因的耐盐性分析

柽柳ThTrx5基因的耐盐性分析

作者：宋鑫东北林业大学

学位级别：硕士

硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种热稳定性的酸性蛋白质,具有抗旱、抗氧化、耐热等抗逆能力,还参与信号转导过程,并且对淀粉合成代谢、种子发芽和苗发育有一定的影响。本研究从柽柳中克隆得到9个Trx基因,通过定量技术分析不同胁迫条... 详细信息

硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种热稳定性的酸性蛋白质,具有抗旱、抗氧化、耐热等抗逆能力,还参与信号转导过程,并且对淀粉合成代谢、种子发芽和苗发育有一定的影响。本研究从柽柳中克隆得到9个Trx基因,通过定量技术分析不同胁迫条件下柽柳Trx基因的时序表达模式。同时,筛选出ThTrx5基因转入拟南芥。通过对盐胁迫下转基因株系盐害指数、幼苗鲜重和氧化型谷胱甘肽的含量测定对转化株系耐盐能力进行评价,并通过转录组及pull down技术研究ThTrx5下游调控基因及互作蛋白,揭示ThTrx5的抗逆机理。研究结果如下:通过生物信息分析得出,柽柳Trx基因C末端的氨基酸序列保守性很高,都含有高度保守的WCGPC,这个保守序列是硫氧还蛋白的二硫化物活性中心,2个Cys残基能可逆地催化许多氧化还原反应。但N末端序列差异很大。ThTrx5基因位于叶绿体,编码233个氨基酸,属于Chloroplastic Thx亚家族。通过Real-time PCR技术研究发现,在NaCl、CdCl2、PEG6000、低温、ABA胁迫下,9种基因的相对表达量均发生了变化,说明不同的逆境胁迫下ThTrx均表现出不同的应答。其中ThTrx5基因在多数处理中均上调表达。对ThTrx5过表达拟南芥和野生型进行盐胁迫处理,发现转基因株系对盐的耐受性明显高于野生型,且GSSG含量高于对照株系,说明ThTrx5基因一定程度上提高了植株的的耐盐能力。利用His pull-down技术筛选ThTrx5互作蛋白,筛选得到5个可能与ThTrx5相互作用的蛋白质,分别为 Catalase、CYP20、ATP synthase subunit beta、2-Cys peroxiredoxin 和 GAPDH。利用高通量Solexa测序技术建立了未处理及盐胁迫处理3 h的野生型和转ThTrx5基因株系4个转录组,结果显示:未处理的野生型株系与转基因ThTrx5株系相比,转ThTrx5基因株系中有差异基因500条,其中115条基因上调表达,385条基因下调表达;盐胁迫处理3h的野生型株系与转基因ThTrx5株系相比,转ThTrx5基因株系中差异表达基因数目为194条,其中66条基因上调表达,128条基因下调表达,其中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷氧还蛋白(Grx)及钙调蛋白高丰度表达,说明在盐胁迫响应中ThTrx5调控这些基因的表达来提高植物的耐盐性。

关键词：柽柳 ThTrx基因盐胁迫 pull-down 转录组

基于1,3,4-噁二唑硫醚结构系列探针的设计与合成

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基于1,3,4-噁二唑硫醚结构系列探针的设计与合成

作者：葛沙沙贵州大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病是一种世界性的农作物细菌病害,其病原菌为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)。由于近年来农作物病原菌的抗药性的逐年增加,用于防治该病的噻枯唑及其类似物等主要药剂的药效也明显下降。1,3,4-噁二唑类衍生物因... 详细信息

水稻白叶枯病是一种世界性的农作物细菌病害,其病原菌为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)。由于近年来农作物病原菌的抗药性的逐年增加,用于防治该病的噻枯唑及其类似物等主要药剂的药效也明显下降。1,3,4-噁二唑类衍生物因其重要的生物活性不仅被广泛应用于医药领域,在农药领域也有一定的潜在应用前景。本课题组在前期和近期的工作中发现1,3,4-噁二唑硫醚结构化合物对水稻白叶枯菌有良好的抑制活性,然而该类化合物对水稻白叶枯病菌的作用靶标却是未知的。基于活性的蛋白质组分析(Activity-based protein profiling,ABPP)技术是寻找靶标、鉴定靶标身份和解析作用位点的重要工具,一般通过基于活性的小分子探针(Activity-based probes,ABPs)和基于亲和力的小分子探针(Affinity-based probes,AfBPs)寻找靶标,然后再结合蛋白质组学和质谱等方法对靶标身份进行鉴定。综上,本课题基于课题组前期研发的1,3,4-噁二唑硫醚类高活性化合物,设计并合成了两类小分子探针,并用相应探针进行了一系列的靶标鉴定实验。其中,探针1-3在引入光反应基团后,药物活性明显下降,且对Xoo的标记几乎没有选择性。在此基础上,进一步将母体结构进行修饰,设计并合成了另外三个小分子探针4-6以及一个阴性对照探针NP。对Xoo的生物活性测试结果表明,探针4保持了与原药相当的生物活性,这就具备了作为ABP的基本条件。后续的探针初筛,浓度依赖性实验,阴性对照实验和竞争性抑制实验结果都表明了,50 kDa左右的蛋白是该类化合物与Xoo相互作用的特异性靶蛋白。pull-down(拉下实验)和质谱鉴定结果表明了,延伸因子Tu是探针4的潜在作用靶标。

关键词： 1,3,4-噁二唑硫醚 ABPP 小分子探针光反应基团靶标鉴定 pull-down

水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选与水稻基因OsRRM及其同源基因OsRRMT相互作用因子的筛选

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水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选与水稻基因OsRRM及其同源基...

作者：刘淑敏华东师范大学

学位级别：硕士

本论文主要包括以下两方面内容： 1．水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选在基因的转录调控网络中，转录因子(反式作用因子)与靶基因间的相互作用是构成基因表达调控网络的基础。它们的作用主要是使每一个基因在复杂的生命活动过程中... 详细信息

本论文主要包括以下两方面内容： 1．水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选在基因的转录调控网络中，转录因子(反式作用因子)与靶基因间的相互作用是构成基因表达调控网络的基础。它们的作用主要是使每一个基因在复杂的生命活动过程中适时、适地、适量地表达。鉴定出转录因子的靶基因可以帮助人们了解复杂生命活动的本质。本论文研究所在实验室以水稻蜡质基因上游-840bp——810bp之间一段能增强基因表达，并能与水稻胚乳核蛋白结合的31bp顺序为鱼饵，利用酵母单杂交系统从水稻cDNA表达文库中筛选到3个编码DNA结合蛋白的阳性克隆，OsBP-73(Oryza sativa Binding Protein)是其中的一个阳性克隆。OsBP-73基因不仅在水稻胚乳组织中表达，而且在根、茎和叶等组织中也都有表达;双链RNA干扰实验又观察到水稻转基因植株在营养生长期出现生长抑制现象。这就暗示着转录因子OsBP-73不仅调控Wx基因表达，影响水稻胚乳组织中的直链淀粉含量，还可能调控一些其它基因的表达，从而影响水稻的生长发育。本文对转录因子OsBP-73在水稻整个基因组的靶基因进行了初步筛选：首先在大肠杆菌中诱导表达获得水稻转录因子OsBP-73的蛋白p512(全长)和p73(非全长，含有DNA结合功能域)，再用纯化后的p73蛋白通过pull-down方法对其靶基因进行了初步筛选，获得22个阳性克隆，为进一步研究转录因子OsBP-73参与的水稻转录调控网络提供依据。 2．水稻基因OsRRM及其同源基因OsRRMT相互作用因子的筛选本论文研究所在实验室通过启动子捕获方法分离到一个在水稻胚乳中特异表达的基因OsRRMo OsRRM具有两个RRM(RNA recognition motif)结构域、一个SPOC(Spen paralog and ortholog C-terminal)结构域和一个类似L-Zip(Leucine zipper)的结构域，是水稻中第一个被报道的Spen基因。Spen基因最早在动物中被命名，在动物中Spen基因家族的成员通常需要和其它蛋白相互作用而发挥其生理功能。因此本文运用酵母双杂交的方法，对水稻OsRRM基因及其同源基因OsRRMT的相互作用因子进行了初步筛选，分别获得了6个和5个阳性克隆，为进一步研究OsRRM和其同源基因OsRRMT在水稻中的生物学功能和分子机制提供一些线索。

关键词： OsBP-73 靶基因 pull-down OsRRM OsRRMT 酵母双杂交蛋白相互作用

黄花棘豆抗逆转录因子OoABF2互作蛋白的筛选与鉴定

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黄花棘豆抗逆转录因子OoABF2互作蛋白的筛选与鉴定

作者：牛斐西北大学

学位级别：硕士

近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下的转录组数据分析显示ABF2类... 详细信息

近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下的转录组数据分析显示ABF2类转录因子可能参与黄花棘豆的抗逆反应,但其调控机理仍不清楚。因此,本研究以前期工作为基础,以黄花棘豆转录因子OoABF2为切入点,对其上游互作进行蛋白筛选与鉴定,为探明黄花棘豆抗逆性的分子机制提供理论依据。(1)本研究以OoABF2转录因子(accession number:KU877410.1)为切入点,结合课题组已有研究工作和国内外文献报道,首先确定SnRK2s蛋白激酶家族为目标基因,随后成功克隆出黄花棘豆中的所有8个SnRK2s激酶家族:暂时命名为OoSnRK2.1-OoSnRK2.8(accession number:MH636330-MH636337)。(2)通过T4 DNA连接酶分别将OoABF2和pGADT7连接,将OoSnRK2s与pGBKT7连接,构建真核重组质粒,利用酵母双杂交技术,在酵母细胞体内筛选鉴定出了与OoABF2转录因子相互作用的SnRK2激酶蛋白为OoSnRK2.1和OoSnRK2.6。(3)构建OoSnRK2.1-pSPYNE、OoSnRK2.6-pSPYNE和OoABF2-pSPYCE重组质粒,利用双分子荧光互补技术,在烟草表皮细胞内再次体内验证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6存在相互关系,且相互作用位点都在细胞核。(4)将OoSnRK2.1和OoSnRK2.6分别与pGEX-4T-1连接,将OoABF2和pET-32a连接,通过原核诱导表达出3个可溶性的目标蛋白,通过pull-down技术在体外进一步确证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6为互作蛋白。(5)综合利用各种生物信息学方法对OoSnRK2.1和OoSnRK2.6基因进行生物信息学分析,解析了这两个蛋白的基本理化性质,结果表明目标蛋白都是亲水性蛋白,都没有跨膜结构域和信号肽,都是核定位蛋白,都包括特定的保守结构域,都含有磷酸化位点。通过构建系统进化树发现OoSnRK2.1蛋白与蒺藜苜蓿(XP 003615157.1)以及鹰嘴豆(XP 004490378.1)蛋白的一致性最高;OoSnRK2.6蛋白也与蒺藜苜蓿(XP013456889.1)蛋白序列同源性最高。(6)在3种不利胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下,运用qRT-PCR技术对目标基因OoSnRK2.1和OoSnRK2.6进行表达谱分析,结果表明:两者都能够由ABA激活,并且同时在3 h处达到较高的转录水平,在NaCl和PEG的处理下,OoSnRK2.1和OoSnRK2.6也能够被诱导表达,结果表明二者可能主要通过依赖ABA信号途径参与抗逆反应。综上所述,本研究表明黄花棘豆OoABF2转录因子和其上游的OoSnRK2.1/OoSnRK2.6激酶家族通过依赖于ABA的信号通路在逆境胁迫中发挥了重要的作用,对于揭示和阐明黄花棘豆抗逆机制具有重要的意义。

关键词：黄花棘豆 OoABF2 OoSnRK2 酵母双杂交双分子荧光互补 pull-down