柽柳ThTrx5基因的耐盐性分析

作     者：宋鑫 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李开隆;李慧玉

授予年度：2015年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：柽柳 ThTrx基因 盐胁迫 Pull-down 转录组 

摘      要：硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种热稳定性的酸性蛋白质,具有抗旱、抗氧化、耐热等抗逆能力,还参与信号转导过程,并且对淀粉合成代谢、种子发芽和苗发育有一定的影响。本研究从柽柳中克隆得到9个Trx基因,通过定量技术分析不同胁迫条件下柽柳Trx基因的时序表达模式。同时,筛选出ThTrx5基因转入拟南芥。通过对盐胁迫下转基因株系盐害指数、幼苗鲜重和氧化型谷胱甘肽的含量测定对转化株系耐盐能力进行评价,并通过转录组及Pull down技术研究ThTrx5下游调控基因及互作蛋白,揭示ThTrx5的抗逆机理。研究结果如下:通过生物信息分析得出,柽柳Trx基因C末端的氨基酸序列保守性很高,都含有高度保守的WCGPC,这个保守序列是硫氧还蛋白的二硫化物活性中心,2个Cys残基能可逆地催化许多氧化还原反应。但N末端序列差异很大。ThTrx5基因位于叶绿体,编码233个氨基酸,属于Chloroplastic Thx亚家族。通过Real-time PCR技术研究发现,在NaCl、CdCl2、PEG6000、低温、ABA胁迫下,9种基因的相对表达量均发生了变化,说明不同的逆境胁迫下ThTrx均表现出不同的应答。其中ThTrx5基因在多数处理中均上调表达。对ThTrx5过表达拟南芥和野生型进行盐胁迫处理,发现转基因株系对盐的耐受性明显高于野生型,且GSSG含量高于对照株系,说明ThTrx5基因一定程度上提高了植株的的耐盐能力。利用His Pull-down技术筛选ThTrx5互作蛋白,筛选得到5个可能与ThTrx5相互作用的蛋白质,分别为 Catalase、CYP20、ATP synthase subunit beta、2-Cys peroxiredoxin 和 GAPDH。利用高通量Solexa测序技术建立了未处理及盐胁迫处理3 h的野生型和转ThTrx5基因株系4个转录组,结果显示:未处理的野生型株系与转基因ThTrx5株系相比,转ThTrx5基因株系中有差异基因500条,其中115条基因上调表达,385条基因下调表达;盐胁迫处理3h的野生型株系与转基因ThTrx5株系相比,转ThTrx5基因株系中差异表达基因数目为194条,其中66条基因上调表达,128条基因下调表达,其中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷氧还蛋白(Grx)及钙调蛋白高丰度表达,说明在盐胁迫响应中ThTrx5调控这些基因的表达来提高植物的耐盐性。