鱼类TLR5与病原配体的识别和信号传导机制研究

作     者：孙晴宇 

作者单位：河南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜启艳;夏晓华

授予年度：2022年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：泥鳅 TLR5 细菌结合 糖结合 Pull-down 

摘      要：Toll样受体是一类非常重要的模式识别受体,能够识别病原相关分子模式,引发免疫反应。泥鳅是我国以及亚洲沿岸各国重要的养殖鱼类,受高密度养殖和水质恶化影响,由细菌、病毒和寄生虫感染引起的病害给鱼类养殖业造成了巨大损失。嗜水气单胞菌作为淡水鱼类传染病诱因之一,会引发泥鳅的败血症甚至死亡。目前泥鳅被嗜水气单胞菌感染后的研究主要集中于生化指标和免疫指标的检测,对致病菌影响鱼类生殖发育缺少系统研究。本实验以泥鳅为研究对象,利用三代测序技术构建了泥鳅不同发育时期性腺(原始生殖腺、已分化尚未成熟的雌雄性腺、成熟非繁殖期雌雄性腺和成熟繁殖期性腺)的转录组文库,通过分析筛选出了与泥鳅性腺发育相关的TLR基因。利用PCR技术扩增了泥鳅TLR5基因和MyD88基因,展开对其序列结构特征、在正常组织中表达以及免疫应答规律的研究。主要获得以下成果:1、TLR5和MyD88的cDNA全长分别是1785 bp和855 bp,推定编码594个、284个氨基酸。蛋白结构分析显示,TLR5具有一个信号肽、九个富含亮氨酸的重复结构域(LRR)、一个富含亮氨酸的重复C末端结构域(LRR-CT),三个富含亮氨酸的重复典型的亚家族结构域(LRR-TYP),跨膜结构域和细胞内Toll/白细胞介素-1受体结构域(TIR);MyD88具有一个死亡结构域和一个TIR结构域。序列分析和进化分析证实,泥鳅TLR5和MyD88序列具有保守性,且均与鲤形目鱼类聚为一大支。2、qPCR检测健康泥鳅TLR5基因的表达分布。结果表明,TLR5在所检组织(脑、鳃、皮肤、肠道、心脏、肾脏、肝脏和性腺)中呈组成型分布且具有性别二态性,在肠道表达量最高,鳃、肾脏和卵巢次之,在心脏中表达最低,这表明TLR5参与了机体各种生命活动。同时我们检测在不同发育时期的泥鳅性腺中不同TLR基因的表达,结果表明在卵巢中TLR5呈现高表达,在精巢中TLR5的表达要低于TLR9和TLR21。在不同发育时期的卵巢中TLR5的表达显著高于精巢。3、嗜水气单胞菌刺激后,在成熟性腺和二期性腺中TLR5以及TLR通路相关基因MyD88、TRAF6、TAK1、AP1、P50均发生了显著性的上调,而上调的TLR信号通路关键基因又可通过NF-κB信号通路和MAPK途径来促进细胞因子(IL-1β,IL-12,TNF-α)的分泌,导致泥鳅性腺中的炎症反应增加。以上结果提示TLR5在性腺组织的抗细菌感染过程中发挥着重要的免疫作用。4、为进一步了解TLR5识别病原体的分子机制,并鉴定不同的LRR结构域的功能,使用p ET30a原核表达系统,构建TLR5胞外结构域(p ET30a-TLR5-1和p ET30aTLR5-2)重组蛋白。通过细菌结合实验和糖结合实验,发现p ET30a-TLR5-1和p ET30a-TLR5-2蛋白能够识别并结合多种细菌,并高饱和的识别脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)。5、为了鉴定TLR5激活TLR信号通路的机制,构建p ET30a-MyD88和p GExTLR5-TIR原核重组质粒,利用Pull-down技术,探究MaTLR5与MaMyD88蛋白互作关系。结果显示,MaTLR5能与MaMyD88相互作用,表明TLR5可以通过识别MyD88激活TLR通路引发免疫反应。