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NIRF对P53蛋白泛素化作用的研究

生物化学与生物物理进展 2006年第2期33卷 163-168页

作者：段昌柱蒲淑萍 TSUTOMU MORI HIDEO KOCHI 邱宗荫重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室重庆400016 The 1st Department of Biochemistry Fukushima Medical UniversityJapan 重庆医科大学医学检验系重庆400016

HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF体外泛素化反应系统中,检测NIRF对P53的体外泛素化.结果表明:NIRF能与P53相互作用,NIRF不仅能与P53特异性结合,而且还会将P53泛素化,这种相互作用在细胞内和细胞外均能发生.推测NIRF可能是P53的一个新的负调节蛋白.

关键词： NIRF P53 GST pull-down 泛素化

柑橘抗溃疡病转录因子CsAP2-09互作蛋白筛选与分析

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园艺学报 2020年第3期47卷 432-444页

作者：祁静静窦万福张庆雯胡安华陈善春雷天刚彭爱红许兰珍姚利晓何永睿李强西南大学/中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔工程技术研究中心重庆400712

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,... 详细信息

以前期获得的柑橘抗溃疡病的正调控转录因子基因CsAP2-09超表达植株为材料,利用GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)联合液相色谱串联质谱(LC–MS/MS)方法筛选并鉴定CsAP2-09的互作蛋白。首先原核表达并纯化GST-CsAP2-09作为诱饵蛋白,然后与CsAP2-09超表达植株叶片总蛋白孵育、洗脱后进行SDS-PAGE验证,最后进行LC–MS/MS鉴定。得到17个互作蛋白,将蛋白进行注释、GO分析、KEGG分析,发现其中5个可能与植物抗病相关(如过氧化氢酶Cs3g27280)。构建这17个蛋白的互作网络,其中14个蛋白的互作关系得到已有数据的支持。对CsAP2-09与互作蛋白的共表达分析发现CsAP2-09超表达引起了16个蛋白表达上调和1个蛋白表达下调。

关键词：柑橘柑橘溃疡病 GST pull-down CsAP2-09 AP2/ERF 互作蛋白

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

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上海交通大学学报（医学版） 2012年第5期32卷 580-584页

作者：张珍珍尹延青周嘉伟乐卫东上海交通大学医学院附属瑞金医院神经科上海200025 中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所上海200031

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回... 详细信息

目的构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pulldown方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用。方法以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用。结果酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMP1融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMP1融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用。结论获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用。

关键词： p43/AIMP1 蛋白表达纯化 GST pull-down 神经中间丝轻链蛋白

腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的表达、纯化及特性分析

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生物工程学报 2004年第3期20卷 377-381页

作者：刘月永冯明光朱杰青姜立杰田波浙江大学生命科学学院微生物研究所杭州310029 中国科学院微生物研究所分子病毒室北京100080 北京农林科学院林果所北京100093

副粘病毒F蛋白的两段七肽重复序列 (HR1和HR2 )在病毒侵染细胞的过程中相互作用形成热稳定的富含α螺旋的异源二聚体 ,此结构的形成引起病毒囊膜与细胞膜的并置而最终导致膜融合的发生。腮腺炎病毒(Mumpsvirus ,MuV)属于副粘病毒科 ,腮... 详细信息

副粘病毒F蛋白的两段七肽重复序列 (HR1和HR2 )在病毒侵染细胞的过程中相互作用形成热稳定的富含α螺旋的异源二聚体 ,此结构的形成引起病毒囊膜与细胞膜的并置而最终导致膜融合的发生。腮腺炎病毒(Mumpsvirus ,MuV)属于副粘病毒科 ,腮腺炎病毒属 ,可能利用与其他副粘病毒相似的侵染机制。本研究对MuV融合蛋白的HR区进行了计算机程序预测 ,并利用大肠杆菌GST融合表达系统对MuVF蛋白HR1和HR2两段多肽进行了表达和纯化 ,通过GSTpull_down实验证实HR1和HR2多肽在体外能够相互作用 ,凝胶过滤层析证明HR1、HR2多肽能够形成多聚体 ,说明MuVF蛋白的HR区的相互作用可能是其发挥融合功能的关键因素。

关键词：腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV) F蛋白七肽重复序列(HR) GST pull-down

人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

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中国医学科学院学报 2006年第2期28卷 154-158页

作者：苏林刘长征邓艳春杨克恭梁植权陈松森中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Ki... 详细信息

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体（c-Kit）配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域（c-Kit/Ig1～3）,研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段（c-Kit/Ig1～3DM）,构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化*** BL21（DE3）诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.

关键词：人干细胞因子受体免疫球蛋白样结构域 his-tag pull-down 酶联免疫结合实验

人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用

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西安交通大学学报（医学版） 2016年第6期37卷 776-782页

作者：张莹刘旭王彬潘秀颉杨陟华周平坤朱茂祥顾永清石河子大学医学院新疆石河子832003 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850 石河子大学生命科学学院新疆石河子832003

目的在细胞水平及体外验证腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体是否存在相互作用。方法采用激光共聚焦免疫荧光实验,通过细胞内蛋白共定位确定蛋白质间的相互作用关系;GST pulldown实验在体外验证CAP1与PIF1及其... 详细信息

目的在细胞水平及体外验证腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体是否存在相互作用。方法采用激光共聚焦免疫荧光实验,通过细胞内蛋白共定位确定蛋白质间的相互作用关系;GST pulldown实验在体外验证CAP1与PIF1及其剪接体是否存在直接的相互作用。结果激光共聚焦免疫荧光实验显示,CAP1与PIF1全长蛋白及其剪接体BC018978没有共定位,但与剪接体AF108138C存在共定位。GST pull-down未检测到CAP1与PIF1全长及其剪接体的相互作用。结论 CAP1与PIF1剪接体蛋白可能存在非直接相互作用。

关键词：腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1) PIF1 激光共聚焦免疫荧光 GST pull-down

酵母双杂交筛选与蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白--泛素-52氨基酸融合蛋白的鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2008年第9期24卷 826-832页

作者：陈碧骆艳婷刘新光梁念慈广东医学院生物化学与分子生物学研究所湛江524023

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α... 详细信息

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.为研究CK2α′亚基在精子发生中的作用机制,将构建于pACT2质粒的人睾丸cDNA文库和人蛋白激酶CK2α′为诱饵蛋白进行酵母双杂交实验.以初步筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白的阳性候选克隆,筛选获得8个阳性克隆,其中1个与人泛素-52氨基酸融合蛋白基因(UBA52)的cDNA序列有高度同源性(100%).GST pull-down实验在细胞外进一步证实了CK2α′与UBA52之间存在相互作用.本实验证明,人泛素-52氨基酸(UBA52)融合蛋白是人CK2α′亚基的相互作用蛋白,它们之间的相互作用对精子发生机制的影响尚不清楚,进一步分子机制研究正在进行中.

关键词：人蛋白激酶CK2α′ 酵母双杂交系统睾丸人泛素-52氨基酸融合蛋白(UBA52) GST pull-down

拟南芥富天冬酰胺蛋白NRP与PP6型磷酸酶FyPP3具有相互作用

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南开大学学报（自然科学版） 2017年第2期50卷 102-107页

作者：朱彤龚清秋刘新奇南开大学药物化学生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系天津300071 南开大学植物学系天津300071

NRP是植物体内被研究发现具有响应胁迫并会引起细胞凋亡的一个蛋白.Fy PP3在植物体内作为一种PP6型的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,可以对Phy A、PIN以及ABI5等蛋白进行去磷酸化修饰,并调控各种响应途径.本文通过酵母双杂交实验发现NRP与Fy PP3... 详细信息

NRP是植物体内被研究发现具有响应胁迫并会引起细胞凋亡的一个蛋白.Fy PP3在植物体内作为一种PP6型的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,可以对Phy A、PIN以及ABI5等蛋白进行去磷酸化修饰,并调控各种响应途径.本文通过酵母双杂交实验发现NRP与Fy PP3之间具有相互作用,且通过GST pull-down验证.随后通过烟草瞬时转化实验,发现NRP定位在细胞质中,Fy PP3同时出现在细胞质与细胞核中,当二者同时存在时,共定位发生在细胞质中.说明NRP与Fy PP3是有相互作用的,且这样的相互作用是发生在细胞质中的.

关键词：蛋白相互作用酵母双杂交 GST pull-down

鸡Ii与B-L基因表达产物的细胞定位与结合活性特征

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中国免疫学杂志 2015年第7期31卷 879-883,889页

作者：罗兰芳余为一陈芳芳安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室合肥230036

目的:研究鸡Ii与B-L基因表达产物在细胞内定位和互相结合的活性特征。方法:将克隆的Ii、B-LA和B-LB基因片段分别插入原核或真核表达质粒;然后分别单独转染或共转染工程菌Rosetta(DE3)或293T细胞。所有重组菌经鉴定后进行诱导表达后再复... 详细信息

目的:研究鸡Ii与B-L基因表达产物在细胞内定位和互相结合的活性特征。方法:将克隆的Ii、B-LA和B-LB基因片段分别插入原核或真核表达质粒;然后分别单独转染或共转染工程菌Rosetta(DE3)或293T细胞。所有重组菌经鉴定后进行诱导表达后再复性。单一表达产物用免疫印迹检测它们的抗原性,共转染表达的产物用pull-down法和(SDS-)PAGE观察其互相结合特征。结果:成功构建了6个原核和真核表达重组质粒。在真核细胞中Ii、B-LA和B-LB基因表达产物定位于细胞浆膜,而原核表达产物经复性后和亲和层析纯化,获得单一蛋白分子。其次,原核表达的Ii与B-LA和B-LB复性蛋白能够诱导产生鼠源抗体,这些抗体特异性结合真核表达产物,表明它们保持相同的免疫原性。最后,用pull-down从共转染的工程菌表达并复性的蛋白分子中分别获得纯化的Ii/B-LA和Ii/B-LB复合物,它们经SDS处理后分别被解离成单体。结论:鸡Ii和B-L基因的原核与真核表达的产物能够保持其抗原性,而原核共表达的Ii和B-L蛋白分子复性后可以互相结合。本研究的结果为进一步研究Ii与B分子关系提供了方法。

关键词：恒定链 B-L pull-down 表达复合物