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TGFβ signaling-induced miRNA participates in autophagic regulation by targeting pras40 in mesenchymal subtype of glioblastoma

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Cancer Biology & Medicine 2020年第3期17卷 664-675页

作者： Yingbin Xie Luyue Chen Junhu Zhou Qixue Wang Chao Yang Can Xu Xiangyu Fan Yanli Tan Yanan Wang Chunsheng Kang Chuan Fang Department of Neurosurgery Hebei University Affiliated HospitalBaoding 071000China Laboratory of Neuro-0neology Tianjin Neurological InstituteDepartment of NeurosurgeryTianjin Medical University General Hospital and Key Laboratory of NeurotraumaVariationand RegenerationMinistry of Education and Tianjin Municipal GovernmentTianjin 300052China Department of Neurosurgery Zhongshan Hospital Xiamen UniversityXiamen 361004China Department of Pathology Hebei University Affiliated HospitalBaoding 071000China Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University Guangzhou 510095China

Objective:Mesenchymal subtype of glioblastoma(mesGBM)is a refractory disease condition characterized by therapeutic failure and tumor recurrence.Hyperactive transforming growth factor-β(TGF-β)signaling could be a signature event in mesGBM,which leads to dysregulation of downstream targets and contribute to malignant transformation.In this study we aimed to investigate the hyperactive TGFβsignaling-mediated pathogenesis and possible downstream targets for the development of novel therapeutic interventions for mesGBM.Methods:GBM-BioDP is an online resource for accessing and displaying interactive views of the TCGA GBM data set.Transcriptomic sequencing followed by bioinformatic analysis was performed to identify dysregulated microRNAs.Target prediction by MR-microT and dual luciferase reporter assay were utilized to confirm the predicted target of novel_miR56.CCK-8 assays was used to assesse cell viability.The miRNA manipulation was proceeded by cell transfection and lentivirus delivery.A plasmid expressing GFP-LC3 was introduced to visualize the formation of autophagosomes.Orthotopic GBM model was constructed forin vivo study.Results:TGFβ1 and TGFβreceptor type II(TβRII)were exclusively upregulated in mesGBM(Ppras40 via seed region complementarity in the 3'untranslated region,and we also confirmed that pras40 is a direct target of novel_miR56 in glioma cells.In vitro,over expression of novel_miR56 in tumor cells significantly promoted proliferation and inhibited autophagy(P<0.05).The expression levels of P62/SQSTM was significantly increased accompanied by the decrease of BECN1 and LC3B-II/I,which indicated that autophagic activity was reduced after novel_miR56 treatment.In addition,over expression of novel_miR56 also promoted tumor growth and inhibited autophagyin

关键词： Autophagy glioblastoma microRNA pras40 TGFβsignaling

Expression of proline-rich Akt-substrate pras40 in cell survival pathway and carcinogenesis

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Acta Pharmacologica Sinica 2005年第10期26卷 1253-1258页

作者： Gavin PORTER Department of Pharmacology Emory University School of Medicine Atlanta GA 30032 USA

Aim: To study the expression of proline-rich Akt-substrate pras40 in the cell survival pathway and tumor progression. Methods: The effects of three key kinase inhibitors on pras40 activity in the cell survival pathway, serum withdrawal,U2O2and overexpression of Akt were tested. The expression of pras40, Akt, Raf and 14-3-3 in normal cells and cancer cell lines was determined by Western blot. Results: The PI3K inhibitors worthmannin and Ly294002, but not rapamycin, completely inhibited the phosphorylation of Akt and pras40. The phosphorylation level of Akt decreased after serum withdrawal and treatment with the MEK inhibi tor Uo 126, but increased after treatment with H2O2at low concentration, whereas none of these treatments changed pras40 activity. 14-3-3 is a pras40 binding protein, and the expression of 14-3-3, like that of pras40, was higher in HeLa cells than in HEK293 cells; pras40 had a stronger phosphorylation activity in A549 and HeLa cancer cells than in HEK293 normal cells. In the breast cancer model (MCF10A/MCF7) and lung cancer model (BEAS/H1198/H1170) we also found the same result: pras40 was constitutively active in H1198/H1170 and MCF7 premalignant and malignant cancer cells, but weakly expressed in MCF10A and BEAS normal cell. We also discussed pras40 activity in other NSCLC cell lines. Conclusion: The PI3K-Akt survival pathway is the main pathway that pras40 is involved in; pras40 is a substrate for Akt, but can also be activated by an Akt independent mechanisms. pras40 activation is an early event during breast and lung carcinogenesis.

关键词： pras40 PI3K-Akt pathway kinase inhibitors 14-3-3 protein

pras40调控TGFBI介导头颈鳞癌侵袭转移的分子机制研究

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PRAS40调控TGFBI介导头颈鳞癌侵袭转移的分子机制研究

作者：黄惠梅中南大学

学位级别：硕士

目的:通过构建头颈鳞癌细胞pras40单克隆敲除细胞株,探索pras40对头颈鳞癌细胞功能的影响,并深入挖掘pras40调控头颈鳞癌侵袭和转移的分子机制。方法:CRISPR/Cas9重组质粒瞬时转染鼠源性MEER细胞,通过流式细胞仪分选强绿色荧光目的细胞... 详细信息

目的:通过构建头颈鳞癌细胞pras40单克隆敲除细胞株,探索pras40对头颈鳞癌细胞功能的影响,并深入挖掘pras40调控头颈鳞癌侵袭和转移的分子机制。方法:CRISPR/Cas9重组质粒瞬时转染鼠源性MEER细胞,通过流式细胞仪分选强绿色荧光目的细胞。通过western blot实验和DNA一代测序验证pras40的敲除情况,构建pras40单克隆敲除细胞株。通过CCK8细胞生长实验和集落形成实验观察pras40对细胞增殖的影响。通过细胞划痕和Transwell实验观察pras40敲除后细胞迁移和侵袭表型的改变。利用western blot实验检测蛋白的表达水平。通过非靶向代谢组学检测pras40敲除后的代谢改变。结果:Western blot实验结果和DNA测序结果显示P3细胞株的pras40基因被完全敲除,成功获得pras40单克隆敲除细胞株。pras40敲除促进HNSCC细胞的体外增殖、迁移和侵袭。上皮间质转化标志物检测显示,E-cadherin表达缺失,Slug表达上调,β-catenin、Vimentin、MMP14没有明显改变,表明pras40敲除可能促进HNSCC细胞的上皮间质转化。非靶向代谢组学分析显示,5种差异代谢物表达均下调,包括L-赖氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、精胺和尿嘧啶。功能和代谢通路富集在β-丙氨酸和天冬氨酸代谢途径。TGFBI在pras40敲除细胞中表达升高,沉默TGFBI抵消了pras40敲除诱导的侵袭和转移。结论:pras40可能调控TGFBI介导头颈鳞癌侵袭和转移。图14幅,表2个,参考文献140篇

关键词：头颈鳞癌 pras40 TGFBI 上皮间质转化转移

pras40与14-3-3蛋白各亚型相互作用的酵母双杂交系统检测

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生物工程学报 2007年第4期23卷 652-656页

作者：刘康武黄蓓谭阳吴东明安徽大学生命科学学院合肥230039

pras40是近几年新发现的Akt作用底物,14-3-3结合蛋白。为确定pras40与14-3-3蛋白7种亚基间相互作用关系,利用gateway方法构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒pEG-pras40及转录激活质粒pJG-pras40,将pras40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵... 详细信息

pras40是近几年新发现的Akt作用底物,14-3-3结合蛋白。为确定pras40与14-3-3蛋白7种亚基间相互作用关系,利用gateway方法构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒pEG-pras40及转录激活质粒pJG-pras40,将pras40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵蛋白质粒及转录激活质粒共转化酵母细胞EGY48,通过氨基酸营养缺陷生长实验及β-半乳糖苷酶显色反应分析两种蛋白相互作用程度。酶切鉴定证实成功地构建了pEG-pras40和pJG-pras40质粒,酵母双杂交实验结果显示pras40可以和14-3-3亚型tau,beta,zeta及epsilon相结合,epsilon较强,beta和zeta次之,tau较弱。此结果将为深入研究pras40与14-3-3蛋白生物学功能及发现药物靶标奠定基础。

关键词： gateway技术 pras40 14-3-3 酵母双杂交

pras40-内质网应激途径介导apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附

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PRAS40-内质网应激途径介导apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细...

作者：周群南华大学

学位级别：硕士

目的:Apelin作为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,具有促进单核细胞向内皮细胞粘附等多种生物学效应。本实验室前期研究发现,apelin-13通过PI3K及NOX4-ROS途径诱导单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附;本课题拟研究apelin-13对人脐静脉内皮细胞... 详细信息

目的:Apelin作为G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,具有促进单核细胞向内皮细胞粘附等多种生物学效应。本实验室前期研究发现,apelin-13通过PI3K及NOX4-ROS途径诱导单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附;本课题拟研究apelin-13对人脐静脉内皮细胞pras40的表达及对内质网应激的影响,并在前期研究的基础上进一步探讨pras40-内质网应激途径介导apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞的粘附作用,揭示apelin-13促单核细胞向内皮细胞粘附新的机理,进一步阐明apelin/APJ参与动脉粥样硬化发生发展的机制。方法:1、Western Blot检测人脐静脉内皮细胞pras40、P-pras40、Bip、CHOP、ICAM-1、VCAM-1的表达;2、生物信息学蛋白相互作用STRING分析软件预测pras40与内质网应激标志蛋白Bip、CHOP之间的相互作用;3、Si RNA沉默人脐静脉内皮细胞pras40,观察其对内质网应激及细胞粘附情况的影响;4、用Calcein AM标记单核细胞后,用荧光显微镜检测apelin-13对单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附的影响;5、用Calcein AM标记单核细胞后,多功能酶标仪检测apelin-13对单核细胞-人脐静脉内皮细胞的粘附效率。6、免疫组织化学观察Apo E-/-(HFD)小鼠动脉粥样硬化冠状动脉血管内皮组织p-pras40 pras40、p-pras40、Bip、CHOP的表达情况。结果:1、Apelin-13浓度(0-1.0μM)依赖和时间(0-24h)依赖促人脐静脉内皮细胞pras40的表达;2、Apelin-13浓度依赖(0-1.0μM)和时间(0-30min)依赖促人脐静脉内皮细胞p-pras40的表达;3、APJ拮抗剂F13A降低Apelin-13促人脐静脉内皮细胞pras40、Bip、CHOP的表达;4、PI3K阻断剂LY294002降低apelin-13促人脐静脉内皮细胞pras40、p-pras40的表达;5、Class III PI3K阻断剂3-MA降低apelin-13促人脐静脉内皮细胞pras40、p-pras40的表达;6、RNA干扰沉默pras40下调apelin-13促人脐静脉内皮细胞pras40的表达;7、生物信息学STRING软件分析提示pras40与内质网标志蛋白Bip、CHOP之间有相互作用;8、Apelin-13浓度(0-1.0μM)依赖和时间(0-24h)依赖诱导人脐静脉内皮细胞内质网应激标志蛋白Bip和CHOP的表达;9、RNA干扰沉默pras40下调apelin-13促人脐静脉内皮细胞内质网网标志蛋白Bip、CHOP的表达;10、Apelin-13浓度(0-1.0μM)依赖和时间(0-24h)依赖促人脐静脉内皮细粘附分子ICAM-1表达;11、RNA干扰沉默pras40下调apelin-13促人脐静脉内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达;12、内质网应激抑制剂Salubrinal阻断apelin-13诱导人脐静脉内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达;内质网诱导剂Tunicamycin对apelin-13诱导人脐静脉内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达无影响;13、RNA干扰沉默pras40下调apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附;14、内质网应激抑制剂Salubrinal抑制apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附;内质网诱导剂Tunicamycin对apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附无影响。15、Apo E-/-(HFD)小鼠动脉粥样硬化模型冠状动脉血管内皮组织p-pras40pras40、p-pras40、Bip、CHOP的表达增加。结论:pras40-内质网应激途径介导apelin-13促单核细胞-人脐静脉内皮细胞粘附。

关键词： Apelin-13 APJ pras40 内质网应激单核细胞人脐静脉内皮细胞细胞粘附

pras40与14-3-3蛋白的分离纯化及相互作用规律的酵母双杂交检测

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PRAS40与14-3-3蛋白的分离纯化及相互作用规律的酵母双杂交检测

作者：刘康武安徽大学

学位级别：硕士

2003年Grace Park等人在利用14-3-3蛋白及Akt抗体筛选Akt作用底物时发现了一种新的由胰岛素诱导出来的14-3-3结合蛋白pras40(Proline-rich-Akt Substate，40kDa)．DNA序列分析及纯化的蛋白体外实验表明，pras40是Akt直接作用的底物，且... 详细信息

2003年Grace Park等人在利用14-3-3蛋白及Akt抗体筛选Akt作用底物时发现了一种新的由胰岛素诱导出来的14-3-3结合蛋白pras40(Proline-rich-Akt Substate，40kDa)．DNA序列分析及纯化的蛋白体外实验表明，pras40是Akt直接作用的底物，且在人体内的各个组织均有表达，尤其以心脏和肝脏内表达量最高．该蛋白的序列分析表明他除了含有AKT磷酸化位点(Thr-246)外不含有任何其他的可别辩识作用位点．然而他却含有高达15％的脯氨酸(普通的蛋白脯氨酸的含量仅为5％)，这些脯氨酸结构域是SH3 and／or WW潜在的结合位点pras40是一种新的发现于PI-3激酶信号通路中的蛋白．虽然它的基本功能尚不清楚，但因为它是Akt的作用底物且为14-3-3的结合蛋白，因此可以预见pras40在细胞的生命活动过程中一定起着十分重要的功能．14-3-3蛋白于1967年首次在牛脑细胞中发现，它是一种酸性的、可溶性异源二聚体蛋白，根据它们在淀粉凝胶中的迁移率命名为14-3-3，其大小约为23-28kD。研究表明它是一个有关连接蛋白和脚手架蛋白的蛋白家族，可以和60多种蛋白相互作用并在所有真核细胞表达，目前已鉴定出在真核细胞中表达的七个亚型。参于真核细胞中的蛋白激酶介导的信号通路，在基因转录、细胞周期调控、前体蛋白运输中也起十分重要的作用。最近的研究发现它在治愈人类疾病，尤其是癌症上也有着广阔的前景．利用pDEST17-14-3-3／BL21及Pdest15-pras40／BL21重组菌株，通过亲和层析分离纯化出了HIS融合的14-3-3七种亚型及GST融合的pras40蛋白．为了初步鉴定pras40与14-3-3的相互作用规律，我们通过gateway技术，构建了用于酵母双杂交系统的质粒pJG-pras40和pEG-pras40，同时通过酶切鉴定，证实成功构建了pEG-pras40和pJG-pras40质粒。将pras40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵蛋白质粒及转录激活质粒共转化酵母细胞，通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用。酵母双杂交实验结果显示pras40可以和14-3-3亚型tau，beta，zeta及epsilon相结合，epsilon较强，beta和zeta次之，tau较弱。通过本实验，初步鉴定了PRS40与14-3-3的相互作用规律，同时14-3-3和pras40蛋白的成功分离纯化为进一步的弄清其相互作用规律、生物学功能及药靶的找寻奠定了基础．

关键词： pras40 14-3-3 蛋白相互作用酵母双杂交蛋白分离纯化 Gateway

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pras40活性调节与功能的研究进展

基础医学与临床 2015年第4期35卷 536-540页

作者：朱燕婷赵迪史道华福建省妇幼保健院药剂科福建福州350000

pras40是蛋白激酶B(PKB/Akt)的作用底物,亦是m TORC1的特异性结合蛋白,有多个位点可发生磷酸化,其中Thr246磷酸化受Akt调控,而Ser183、Ser212及Ser221等磷酸化主要受m TORC1调控。磷酸化修饰的pras40可调节与Raptor及14-3-3等蛋白的结合... 详细信息

pras40是蛋白激酶B(PKB/Akt)的作用底物,亦是m TORC1的特异性结合蛋白,有多个位点可发生磷酸化,其中Thr246磷酸化受Akt调控,而Ser183、Ser212及Ser221等磷酸化主要受m TORC1调控。磷酸化修饰的pras40可调节与Raptor及14-3-3等蛋白的结合,参与Akt、m TORC1活性的调控。pras40具有调控细胞增殖、参与神经损伤保护等作用,在胰岛素抵抗、神经退行性病变及肿瘤中扮演重要角色,有望成为药物作用的新靶点。

关键词： pras40 磷酸化修饰胰岛素抵抗神经退行性病变癌症

mTOR对pras40表达的调控及其分子机制

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mTOR对PRAS40表达的调控及其分子机制

作者：周家胜大连医科大学

学位级别：硕士

背景:结节性硬化症是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征,好发于儿童,常可引起多器官或系统内的肿瘤,包括皮肤口鼻三角区皮脂腺瘤、视网膜胶质瘤、肾血管平滑肌脂肪瘤、心脏横纹肌瘤和肺淋巴管肌瘤病等。该病患者常可见9号染色体上T... 详细信息

背景:结节性硬化症是一种常染色体显性遗传的神经皮肤综合征,好发于儿童,常可引起多器官或系统内的肿瘤,包括皮肤口鼻三角区皮脂腺瘤、视网膜胶质瘤、肾血管平滑肌脂肪瘤、心脏横纹肌瘤和肺淋巴管肌瘤病等。该病患者常可见9号染色体上TSC1或16号染色体上TSC2的突变,分别导致hamartin或tuberin的功能障碍。这两种蛋白可形成复合物,调节mTOR的活性,因此TSC1或TSC2的突变可导致mTOR活化从而影响细胞增殖与分化。因此,mTOR抑制剂雷帕霉素和依维莫司被应用于临床治疗结节性硬化症的相关肿瘤和mTOR异常活化的肿瘤,但具有一定的局限性,还需要进一步研究mTOR活化而导致疾病的具体机制,以求为疾病的治疗提供新策略。pras40(由AKT1S1基因编码)是AKT的底物,也是mTORC1的亚基。分别在T246与S183位点被AKT及mTOR磷酸化,同时也可以影响这两条信号通路的活化。因此pras40在PI3K和mTOR信号通路中占据着重要的地位。MiR-142-3p属于非编码小RNA分子,能够通过与目的m RNA结合而调控其表达。近年来研究显示,miR-142-3p可抑制肿瘤的发生发展,在多数肿瘤内的表达水平均有下调。研究表明,在结节性硬化症患者的血清内,miR-142-3p的表达水平下降。而本课题组前期研究显示,pras40是miR-142-3p的靶点之一,miR-142-3p通过结合pras40 m RNA的3’UTR,抑制其表达。胞嘧啶碱基C5位甲基化是哺乳动物基因组的一种表观遗传修饰,在转录调控中起重要作用。TET家族是一类5-甲基胞嘧啶双加氧酶,包括TET1、TET2和TET3,能够将被修饰的基因组碱基5-甲基胞嘧啶(5m C)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),进而催化其转变为5-甲酰胞嘧啶(5f C)及5-羟基胞嘧啶(5ca C),然后经DNA损伤修复机制致DNA去甲基化。有研究显示,在肿瘤中TET家族蛋白突变可通过上调编码miRNA的DNA甲基化水平而导致miRNA表达下降;另外还有学者发现雷帕霉素可诱导TET2的表达。目的:研究pras40对结节性硬化症相关肿瘤的发生、发展的影响;探索pras40与mTOR的关系及mTOR调控pras40表达的机制;期待为结节性硬化症及其相关肿瘤的诊断与治疗提供新思路。方法:通过Western blot或RT-qPCR检测Tsc2MEF细胞及Tsc2MEF细胞中pras40蛋白质或m RNA的表达水平;用雷帕霉素处理Tsc2MEF细胞后,经Western blot和RT-qPCR分别检测细胞内pras40的蛋白质及m RNA水平,并通过CCK-8实验检测细胞的增殖差异;利用RT-qPCR检测Tsc2MEF与Tsc2MEF细胞之间miR-142-3p的表达差异。miR-142-3p转染Tsc2MEF后,通过CCK-8及western blot实验比较各组之间增殖变化及pras40表达水平变化。对TCGA数据库中肾癌、乳腺癌和肺癌的RNAseq数据进行GSEA分析,分析mTOR信号通路活化与pras40 m RNA表达水平之间的关系。通过RT-qPCR检测Tsc2MEF与Tsc2MEF细胞之间TET1、TET2的表达差异,及雷帕霉素处理Tsc2MEF后TET1、TET2的表达水平变化。通过GSEA分析研究mTOR信号通路活动与TET1及TET2之间的关系。结果:1.与Tsc2MEF细胞相比,Tsc2MEF细胞中的pras40蛋白质及m RNA表达水平均上调;雷帕霉素处理Tsc2MEF细胞后,pras40蛋白质及m RNA表达水平均下调;2.敲低pras40明显抑制Tsc2与Tsc2MEF细胞细胞增殖,且抑制作用不受mTOR活性影响;3.TCGA肺癌、肾癌和乳腺癌组织样本RNAseq结果分析显示,AKT1S1的m RNA表达水平与mTOR信号通路活化呈正相关;4.在Tsc2MEF细胞中过表达mir-142-3p可抑制pras40的表达及细胞增殖;5.与Tsc2MEF细胞相比,Tsc2MEF细胞中的miR-142-3p表达水平下降;6.TCGA肺癌和肾癌组织样本RNAseq结果分析显示,TET1及TET2的表达与mTOR信号通路活动呈负相关。结论:1.mTOR活化后抑制TET/miR-142-3p表达从而促进pras40表达增高;2.敲低pras40抑制mTOR活化依赖性与非依赖性的细胞增殖。

关键词： mTOR 结节性硬化症 miR-142-3p pras40

PGK1与pras40的相互作用在尤文肉瘤形成中的作用及机制研究

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PGK1与PRAS40的相互作用在尤文肉瘤形成中的作用及机制研究

作者：王玉珍大连医科大学

学位级别：硕士

目的:尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma)是一种好发于儿童和青少年的肿瘤,具有高侵袭性,极易转移的特点,恶性程度极高。pras40(proline-rich AKT substrate of40 k Da)能够促进细胞存活、增殖和转移,抑制凋亡和老化,调控蛋白降解和免疫,在多... 详细信息

目的:尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma)是一种好发于儿童和青少年的肿瘤,具有高侵袭性,极易转移的特点,恶性程度极高。pras40(proline-rich AKT substrate of40 k Da)能够促进细胞存活、增殖和转移,抑制凋亡和老化,调控蛋白降解和免疫,在多种肿瘤的形成过程中起重要作用。本课题组的前期研究结果证实下调pras40的表达可抑制尤文肉瘤细胞的增殖、运动、侵袭及在裸鼠体内的成瘤性。但pras40在尤文肉瘤发生发展中的具体分子作用机制尚不明确。本课题的主要目的是筛查并确定与pras40相互作用的蛋白,以弄清其作用网络;研究该相互作用对pras40的影响;并进一步探索该相互作用对尤文肉瘤形成的影响,以期为进一步阐明pras40在肿瘤形成中的作用机制提供新线索。方法:在尤文肉瘤细胞系A673细胞中,通过免疫共沉淀联合质谱的方法筛选可能与pras40相互作用的蛋白。在A673和293T细胞中利用免疫共沉淀联合免疫印迹法或免疫荧光染色法验证磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase 1,PGK1)是否与pras40相互作用。用si RNA敲低PGK1后,利用免疫印迹法和实时PCR(Real-time PCR)技术检测pras40在细胞内的表达量,阐明PGK1对pras40表达的影响。在低氧(1%)条件下培养A673细胞,通过免疫共沉淀法观察二者结合的变化,研究低氧环境是否影响二者的相互作用。结果:在尤文肉瘤细胞A673中,免疫共沉淀联合质谱确定8种与pras40相互作用的蛋白,包括HSP7C(Heat shock cognate 71KD protein)、X射线修复交叉互补基因6(X-Ray Repair Cross Complementing 6)、丝氨酸蛋白抑制因子B4(Serpin B4,SPB4)、14-3-3S(14-3-3 protein sigma)、PGK1、M2-型丙酮酸激酶(Pyruvate kinase isozymes M2,PKM2)、RS18(40S ribosomal protein S18)和亲斑蛋白1(Plakophilin 1,PKP1)。免疫共沉淀和免疫荧光染色实验验证了PGK1与pras40之间的相互作用。敲低PGK1,使pras40在A673细胞中的表达水平升高。氯化钴处理或者低氧(1%)培养,可明显诱导A673细胞中缺氧诱导因子(HIF-1a)的表达并上调PGK1表达水平。低氧培养可抑制PGK1与PR AS40之间的相互作用。结论:pras40在尤文肉瘤细胞中可与应激、免疫、DNA损伤修复、糖酵解、细胞分裂相关蛋白相互作用。pras40和PGK1之间存在非常明显的相互作用关系,敲低PGK1导致pras40表达升高,低氧环境可抑制PGK1与pras40之间的相互作用。为阐明pras40在尤文肉瘤中的作用机制提供了线索。

关键词： pras40 PGK1 尤文肉瘤蛋白质—蛋白质相互作用