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nefas在酮病奶牛脂肪动员以及氧化应激中的作用

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生物学杂志 2018年第3期35卷 99-101,117页

作者：邹苏萍郝宁陶焕青明鹏飞徐怡钟梁婷冯士彬王希春吴金节李玉安徽农业大学动物科技学院合肥230036

糖脂代谢紊乱导致的营养代谢性疾病是奶牛酮病的病因,在围产奶牛中比较多见。由于围产期奶牛泌乳需要消耗大量能量,而此时能量摄入不足,因此机体需要动员脂肪,大量的脂肪动员会导致血液非酯化脂肪酸和酮体浓度上升。将以围产期酮病奶牛... 详细信息

糖脂代谢紊乱导致的营养代谢性疾病是奶牛酮病的病因,在围产奶牛中比较多见。由于围产期奶牛泌乳需要消耗大量能量,而此时能量摄入不足,因此机体需要动员脂肪,大量的脂肪动员会导致血液非酯化脂肪酸和酮体浓度上升。将以围产期酮病奶牛脂肪动员产物nefas的产生、利用和作用为重点一一论述,旨在为深入研究奶牛酮病的发病机制提供理论依据。

关键词：奶牛酮病 nefas MAPK NF-κB 氧化应激

nefas激活NF-κB-Orai1信号通路介导犊牛肝细胞脂肪酸从头合成的调控机制

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NEFAs激活NF-κB-Orai1信号通路介导犊牛肝细胞脂肪酸从头合成的...

作者：邹颖黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

围产期奶牛脂肪肝病是一种重要的奶牛营养代谢性疾病,它常发于围产期的高产奶牛,其发病原因是围产期的奶牛采食量下降,泌乳需求上升,泌乳高峰早于采食高峰导致机体发生能量负平衡,使脂肪动员产生能量来供给机体泌乳需要,而脂肪动员生成... 详细信息

围产期奶牛脂肪肝病是一种重要的奶牛营养代谢性疾病,它常发于围产期的高产奶牛,其发病原因是围产期的奶牛采食量下降,泌乳需求上升,泌乳高峰早于采食高峰导致机体发生能量负平衡,使脂肪动员产生能量来供给机体泌乳需要,而脂肪动员生成的大量非酯化脂肪酸(nefas)运输到肝脏,在肝脏合成了大量的甘油三酯(TG),远远超过了肝脏能够以极低密度脂蛋白(VLDL)形式输出的量,从而导致了大量TG在肝脏蓄积。围产期奶牛脂肪肝病降低了奶牛的采食量与产奶量,损害了奶牛的繁殖能力和免疫功能,降低了牛奶的质量,提高了奶牛患各种产后疾病的风险及奶牛的淘汰率,每年都会给养牛业造成一笔巨大的经济损失。为探究nefas对奶牛脂肪酸从头合成调控因子的影响,在奶牛脂肪肝病发展中的作用,以及探究Ca相关的NF-κB-Orai1信号通路是否在nefas介导的奶牛脂肪酸从头合成调节过程中有所参与,本研究通过体外培养犊牛原代肝细胞,添加nefas刺激细胞,并加入NF-κB抑制剂Wogonin与Orai1抑制剂2-APB,通过检测细胞内Ca浓度的变化,脂肪酸从头合成相关调控因子SREBP-1c、ACC1和FAS的表达调控,以及观测细胞脂滴生成情况,来综合评价nefas在奶牛脂肪肝病发生发展中的影响,并通过细胞沉默实验,验证了Orai1信号通路在奶牛脂肪酸从头合成过程中的参与作用。胞内Ca流式细胞术检测结果显示,随着nefas刺激时间的延长,胞内Ca浓度在不断升高,刺激3 h与刺激12 h时的胞内Ca与0 h相比差异显著(p<0.05),刺激6 h与刺激9 h时胞内Ca与0 h相比差异极显著(p<0.01)。QRT-PCR检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平的结果显示,NEFA组的NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著高于control组(p<0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的NF-κB p65、Srebp-1c的mRNA表达水平均显著低于NEFA组(p<0.05),Orai1、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p<0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的Fas的mRNA表达水平显著低于NEFA组(p<0.05),NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p<0.01)。Western Blot方法检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、ORAI1、SREBP-1、FAS、ACC1的蛋白表达水平的结果显示,NEFA组的ORAI1、ACC1的蛋白表达水平均显著高于control组(p<0.05),NF-κB p65、SREBP-1、FAS的蛋白表达水平均极显著高于control组(p<0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的ORAI1、SREBP-1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p<0.05),NF-κB p65、FAS、ACC1的蛋白表达水平均极显著低于NEFA组(p<0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的FAS、ACC1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p<0.05),NF-κB p65的蛋白表达水平极显著低于NEFA组(p<0.01)。激光共聚焦荧光检测犊牛原代肝细胞脂滴生成情况结果显示,犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的脂滴生成水平有所差异,NEFA组的脂滴生成水平极显著高于control组(p<0.01);经2-APB、Wogonin试剂预处理的NEFA组的脂滴生成水平均显著低于NEFA组(p<0.05)。沉默Orai1基因可见Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA与蛋白表达水平都有了显著下调(p<0.05)。NF-κB能够调控奶牛体内Orai1信号通路,刺激细胞Ca内流,参与调节肝脏脂肪酸从头合成调控因子表达水平上调,使肝脂合成增多,从而提高了围产期奶牛患脂肪肝病的风险。本实验对于围产期奶牛脂肪肝的发生机制研究、预防和诊治具有重要的意义,对Orai1通路的研究或可开启围产期奶牛脂肪肝病药物治疗研发的新道路。

关键词：脂肪肝围产期奶牛犊牛原代肝细胞 nefas NF-κB Orai1

高浓度nefas血症通过抑制PGC-1α引起奶牛肝细胞脂质蓄积

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吉林农业大学学报 2023年第1期45卷 116-120页

作者：王兴慧朱艺玮李伟李金霞李心慰刘国文吉林大学动物医学学院长春130062

酮病奶牛高脂肪酸(nefas)血症可引起肝脂蓄积,但其机制尚未完全明确。因此通过酮病奶牛体内试验和培养奶牛肝细胞体外试验,体外添加nefas和过表达过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α),采用蛋白免疫印迹、实时荧光定量... 详细信息

酮病奶牛高脂肪酸(nefas)血症可引起肝脂蓄积,但其机制尚未完全明确。因此通过酮病奶牛体内试验和培养奶牛肝细胞体外试验,体外添加nefas和过表达过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α),采用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR和生化检测等技术,检测PGC-1α表达及脂代谢相关指标变化。结果表明:酮病奶牛肝脏PGC-1αmRNA和蛋白表达水平显著低于健康奶牛,高浓度nefas(1.2,2.4 mmol/L)可显著抑制奶牛肝细胞PGC-1αmRNA和蛋白及脂肪酸氧化基因ACO、CPT-1和CPT-2的表达,促进脂合成基因FAS、ACC和SCD-1的表达,导致奶牛肝细胞脂蓄积。体外过表达PGC-1α能够逆转nefas所引起的脂代谢基因的表达紊乱,并且显著降低高nefas所引起的奶牛肝细胞脂蓄积。说明酮病奶牛高NE⁃FAs血症可以通过抑制PGC-1α的表达,引起肝脂代谢酶基因表达紊乱,进而导致肝细胞脂蓄积。

关键词：奶牛酮病 PGC-1α nefas 脂代谢

高nefas作用下bta-miR-novel3对奶牛棕色脂肪细胞脂沉积能力的影响

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高NEFAs作用下bta-miR-novel3对奶牛棕色脂肪细胞脂沉积能力的影响

作者：张强吉林大学

学位级别：硕士

处于围产期的奶牛由于能量需求的上升和干物质采食量的减少,造成奶牛能量负平衡状态(energy negative balance,NEB)。此时,脂肪细胞内脂肪动员迅速加剧并进一步发展为脂代谢紊乱,造成高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,nefas)... 详细信息

处于围产期的奶牛由于能量需求的上升和干物质采食量的减少,造成奶牛能量负平衡状态(energy negative balance,NEB)。此时,脂肪细胞内脂肪动员迅速加剧并进一步发展为脂代谢紊乱,造成高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,nefas)血症,它是围产期奶牛主要的临床病理学特征。而过量nefas的释放会导致奶牛各种生产疾病,如奶牛酮病、脂肪肝、氧化应激等,同时,高nefas的脂毒性也会严重损害奶牛生产健康。棕色脂肪细胞在动员脂肪,调节脂质代谢中具有重要作用,因此,探究奶牛棕色脂肪细胞中脂质代谢与奶牛高nefas血症的关系显得十分必要。MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA分子(约22个核苷酸),其最主要的作用是通过与靶基因mRNA 3’端的非编码区相结合,从而抑制靶基因的表达以调控细胞各项生理功能。MiRNA的作用十分广泛,研究发现,miRNA调节着哺乳动物大约30%-40%的基因。但是,奶牛棕色脂肪细胞在高nefas的miRNA调控机制却罕有报道。因此,本论文的研究目的旨在研究高nefas状态下,miRNA对奶牛棕色脂肪细胞的调节作用,为奶牛高nefas血症的防治提供新思路和策略。本研究首先向体外培养的原代棕色脂肪细胞(选用11天完全分化成熟的细胞)培养液中添加nefas(0 mmol/L,0.3 mmol/L,0.6 mmol/L,1.2 mmol/L,2.4mmol/L),模拟奶牛高nefas血症时的脂肪细胞状态。结果发现,当nefas浓度高于1.2 mmol/L时细胞内甘油三脂(Triacylglycerol,TG)的含量显著减少,培养液中甘油含量显著上升。为探究其内在调节机制,应用此模型,采用二代测序技术检测高nefas作用下(1.2 mmol/L)棕色脂肪细胞内miRNA表达谱的变化。测序结果发现,与空白对照组相比,bta-miR-novel3表达显著升高,甘油-3-磷酸酰转移酶1(glycerol-3-phosphate acyltransferases-1,GPAT1)表达显著降低。实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blotting,Western Blot)试验也进一步验证了上述结果。双荧光素酶报告基因实验结果表明,bta-miR-novel3和GPAT1之间的靶向关系。进一步研究发现,通过转染bta-miR-novel3模拟体(mimics),将bta-miR-novel3在奶牛棕色脂肪细胞内过表达,结果显示mimics组脂肪细胞内GPAT1表达量和胞内TG含量显著下降,培养液中甘油含量显著上升;转染bta-miR-novel3抑制剂(inhibitor)抑制bta-miR-novel3的表达时,结果显示inhibitor组脂肪细胞内GPAT1表达量和胞内TG含量显著增加,培养液中甘油含量显著下降。另外,用高浓度nefas(1.2 mmol/L)处理脂肪细胞,同时转染bta-miR-novel3 inhibitor抑制bta-miR-novel3的表达,结果显示相较nefas组,bta-miR-novel3 inhibitor组GPAT1的表达量和胞内TG含量得到回升,脂滴(Lipid droplets,LDs)变大,培养液中甘油含量下降。上述结果表明,通过抑制bta-miR-novel3的表达可以改善高浓度nefas(1.2 mmol/L)对棕色脂肪细胞脂肪蓄积能力的损害。综上所述,高浓度nefas会引起奶牛体外培养原代棕色脂肪细胞bta-miRnovel3的表达上调,而bta-miR-novel3则会通过抑制靶基因GPAT1的表达来抑制TG合成,从而加重nefas的产生,可能会进一步加重高nefas血症。

关键词： nefas 棕色脂肪细胞高通量测序 miRNA GPAT1 TG

非酯化脂肪酸对原代培养犊牛肝细胞胰岛素信号通路的影响

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中国兽医学报 2016年第3期36卷 508-512页

作者：杜希良王亚洲杨宇宸赵志波刘欢张世奇王哲李心慰刘国文吉林大学动物医学学院吉林长春130062

旨在探讨非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acids,nefas)对体外原代培养犊牛肝细胞胰岛素信号通路的影响及SIRT1在其中的调控作用。选择培养48h的原代犊牛肝细胞,添加不同浓度的nefas(0、0.6、1.2、1.8mmol/L),继续培养12h,胰岛素... 详细信息

旨在探讨非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acids,nefas)对体外原代培养犊牛肝细胞胰岛素信号通路的影响及SIRT1在其中的调控作用。选择培养48h的原代犊牛肝细胞,添加不同浓度的nefas(0、0.6、1.2、1.8mmol/L),继续培养12h,胰岛素处理组在收样前用100nmol/L胰岛素处理30min,每个浓度3个重复。另外选取已培养48h的细胞,用SIRT1抑制剂Nicotinamide(10mmol/L)处理12h,胰岛素处理组在收样前用100 mmol/L胰岛素处理30min。运用免疫印迹Western blot方法,检测nefas和Nicotinamide对肝细胞胰岛素信号通路关键蛋白IR和Akt的磷酸化水平及SIRT1蛋白表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,1.2、1.8 mmol/L nefas组胰岛素刺激的IR磷酸化水平显著降低(Pnefas浓度为0.6 mmol/L时即显著降低(Pnefas为1.2、1.8mmol/L显著降低(Pnefas可以损伤体外原代培养肝细胞的胰岛素信号通路,SIRT1在nefas损伤的胰岛素信号通路中发挥重要作用。

关键词： nefas SIRT1 胰岛素信号通路肝细胞犊牛

非酯化脂肪酸激活p38MAPK信号通路诱导体外培养的奶牛肝细胞凋亡

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非酯化脂肪酸激活p38MAPK信号通路诱导体外培养的奶牛肝细胞凋亡

作者：宋玉祥吉林大学

学位级别：硕士

围产期奶牛常处于能量负平衡(NEB)状态，部分奶牛会发生糖脂代谢紊乱疾病，例如奶牛酮病和脂肪肝。能量负平衡诱发脂肪动员，造成高非酯化脂肪酸(nefas)血症，这是奶牛机体的代偿性调节，但高nefas是奶牛酮病和脂肪肝等常见代谢障碍性... 详细信息

围产期奶牛常处于能量负平衡(NEB)状态，部分奶牛会发生糖脂代谢紊乱疾病，例如奶牛酮病和脂肪肝。能量负平衡诱发脂肪动员，造成高非酯化脂肪酸(nefas)血症，这是奶牛机体的代偿性调节，但高nefas是奶牛酮病和脂肪肝等常见代谢障碍性疾病的重要致病因素之一。nefas在肝细胞氧化供能，缓解能量亏欠起着重要作用;研究表明大量的nefas可以引起氧化应激，造成肝损伤，但其分子机制尚不清楚。本实验通过体外培养奶牛肝细胞，添加不同浓度的nefas，检测肝细胞氧化应激水平，凋亡水平以及探究nefas产生上述作用的分子机制，为奶牛代谢障碍性疾病的防治和新药物的开发提供了理论依据。体外培养的奶牛肝细胞，添加不同浓度的nefas、葡萄糖(GLU)和抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC），检测肝细胞的氧化抗氧化指标。结果显示，高浓度的nefas可以显著增加肝细胞内的活性氧（ROS）水平和氧化应激产物丙二醛（MDA）的含量，显著降低抗氧化指标过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物酶歧化酶（SOD）的酶活性及总抗氧化能力（TAC）的含量;同时增加氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量而降低谷胱甘肽（GSH）含量，导致GSH/GSSG比值显著降低。且高浓度nefas处理的肝细胞凋亡率显著增加，而在葡萄糖和抗氧化剂NAC作用后，肝细胞凋亡率显著降低。以上结果表明高浓度的nefas诱发体外培养的奶牛肝细胞氧化应激，促进凋亡;而葡萄糖和NAC可以抑制nefas诱导的氧化应激，降低肝细胞凋亡率。提示能量缺乏时，高浓度的nefas可以诱发肝细胞氧化应激并且导致奶牛肝细胞凋亡。高浓度nefas作用于体外培养奶牛肝细胞24h后，检测p38α的酶活和p38mRNA表达水平，结果表明nefas可增加p38α酶活性和p38mRNA表达水平，且呈剂量依赖关系;通过nefas时间梯度实验发现肝细胞作用nefas后在9h时p38磷酸化水平最高，提示最佳作用时间是9h。随后检测肝细胞p38下游转录因子p53和Nrf2的表达水平和转录活性，结果表明nefas可以增加p53的核内定位和转录活性，降低Nrf2的核内定位和转录活性;而NAC、GLU和SB203580均可以抑制nefas对转录因子p53和Nrf2的作用，说明转录因子p53和Nrf2参与nefas激活p38信号通路介导体外培养的奶牛肝细胞凋亡的过程。进一步检测凋亡相关基因p38，p-p38，Caspase3，Cleaved Caspase3，Caspase9，Bax，Bcl-2和Cleaved PARP等的表达水平。结果显示，nefas促进促凋亡基因的表达，而抑制抑凋亡基因的表达。以上结果表明nefas通过激活p38来促进p53的表达和活性，而抑制Nrf2的表达和活性，促进凋亡相关基因的表达，而抑制抗凋亡基因的表达，诱发奶牛肝细胞凋亡。通过以上实验得出结论：高浓度的nefas可以引起体外培养奶牛肝细胞氧化应激。nefas导致的氧化应激会进一步激活p38MAPK信号通路，促进p53的表达、核定位和转录活性，抑制Nrf2的表达、核定位和转录活性，促进促凋亡基因的表达，而降低抑凋亡基因的表达，增加肝细胞凋亡率;抗氧化剂NAC、GLU和p38MAPK抑制剂均降低了nefas诱发的促肝细胞凋亡作用，说明nefas可以激活ROS-p38-p53/Nrf2信号通路诱导体外培养的奶牛肝细胞凋亡。

关键词： nefas 氧化应激 p38信号通路 p53 Nrf2