NEFAs激活NF-κB-Orai1信号通路介导犊牛肝细胞脂肪酸从头合成的调控机制

作     者：邹颖 

作者单位：黑龙江八一农垦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张洪友

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：脂肪肝 围产期奶牛 犊牛原代肝细胞 NEFAs NF-κB Orai1 

摘      要：围产期奶牛脂肪肝病是一种重要的奶牛营养代谢性疾病,它常发于围产期的高产奶牛,其发病原因是围产期的奶牛采食量下降,泌乳需求上升,泌乳高峰早于采食高峰导致机体发生能量负平衡,使脂肪动员产生能量来供给机体泌乳需要,而脂肪动员生成的大量非酯化脂肪酸(NEFAs)运输到肝脏,在肝脏合成了大量的甘油三酯(TG),远远超过了肝脏能够以极低密度脂蛋白(VLDL)形式输出的量,从而导致了大量TG在肝脏蓄积。围产期奶牛脂肪肝病降低了奶牛的采食量与产奶量,损害了奶牛的繁殖能力和免疫功能,降低了牛奶的质量,提高了奶牛患各种产后疾病的风险及奶牛的淘汰率,每年都会给养牛业造成一笔巨大的经济损失。为探究NEFAs对奶牛脂肪酸从头合成调控因子的影响,在奶牛脂肪肝病发展中的作用,以及探究Ca相关的NF-κB-Orai1信号通路是否在NEFAs介导的奶牛脂肪酸从头合成调节过程中有所参与,本研究通过体外培养犊牛原代肝细胞,添加NEFAs刺激细胞,并加入NF-κB抑制剂Wogonin与Orai1抑制剂2-APB,通过检测细胞内Ca浓度的变化,脂肪酸从头合成相关调控因子SREBP-1c、ACC1和FAS的表达调控,以及观测细胞脂滴生成情况,来综合评价NEFAs在奶牛脂肪肝病发生发展中的影响,并通过细胞沉默实验,验证了Orai1信号通路在奶牛脂肪酸从头合成过程中的参与作用。胞内Ca流式细胞术检测结果显示,随着NEFAs刺激时间的延长,胞内Ca浓度在不断升高,刺激3 h与刺激12 h时的胞内Ca与0 h相比差异显著(p0.05),刺激6 h与刺激9 h时胞内Ca与0 h相比差异极显著(p0.01)。QRT-PCR检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平的结果显示,NEFA组的NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著高于control组(p0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的NF-κB p65、Srebp-1c的mRNA表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),Orai1、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的Fas的mRNA表达水平显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01)。Western Blot方法检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、ORAI1、SREBP-1、FAS、ACC1的蛋白表达水平的结果显示,NEFA组的ORAI1、ACC1的蛋白表达水平均显著高于control组(p0.05),NF-κB p65、SREBP-1、FAS的蛋白表达水平均极显著高于control组(p0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的ORAI1、SREBP-1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65、FAS、ACC1的蛋白表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的FAS、ACC1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65的蛋白表达水平极显著低于NEFA组(p0.01)。激光共聚焦荧光检测犊牛原代肝细胞脂滴生成情况结果显示,犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的脂滴生成水平有所差异,NEFA组的脂滴生成水平极显著高于control组(p0.01);经2-APB、Wogonin试剂预处理的NEFA组的脂滴生成水平均显著低于NEFA组(p0.05)。沉默Orai1基因可见Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA与蛋白表达水平都有了显著下调(p0.05)。NF-κB能够调控奶牛体内Orai1信号通路,刺激细胞Ca内流,参与调节肝脏脂肪酸从头合成调控因子表达水平上调,使肝脂合成增多,从而提高了围产期奶牛患脂肪肝病的风险。本实验对于围产期奶牛脂肪肝的发生机制研究、预防和诊治具有重要的意义,对Orai1通路的研究或可开启围产期奶牛脂肪肝病药物治疗研发的新道路。