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mir-382对胃癌细胞系MGC-803迁移、侵袭和增殖的影响

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中华医学杂志 2017年第8期97卷 612-615页

作者：汪毅步鹏李峰刘晓玲徐钧国家癌症中心中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院VIP病房北京100021 山西省肿瘤医院分子生物室山西省肿瘤医院病理科山西省肿瘤医院外科中国医学科学院北京协和医学院基础学院生物化学系

目的探讨mir-382对胃癌细胞系MGC-803迁移、侵袭和增殖的影响.方法实时（Real-time）聚合酶链反应（PCR）分析50例胃癌组织（C）及其癌旁正常组织（N）中mir-382的表达水平;用pcDNA3.1载体构建过表达mir-382的重组质粒（pcDNA-mir-382... 详细信息

目的探讨mir-382对胃癌细胞系MGC-803迁移、侵袭和增殖的影响.方法实时（Real-time）聚合酶链反应（PCR）分析50例胃癌组织（C）及其癌旁正常组织（N）中mir-382的表达水平;用pcDNA3.1载体构建过表达mir-382的重组质粒（pcDNA-mir-382）,实现mir-382在MGC-803细胞中的过表达;分别用划痕实验、Transwell和CCK-8法检测细胞迁移、侵袭和增殖能力.结果与癌旁对照组相比,41例（82％）胃癌组织中出现mir-382的表达下调;过表达mir-382能显著抑制MGC-803细胞的迁移、侵袭和增殖能力（P＜0.05）.结论 mir-382的表达下调可能与胃癌的进展有关,过表达mir-382可以抑制胃癌MGC-803细胞的迁移、侵袭和增殖.

关键词：胃肿瘤 mir-382 迁移侵袭增殖

mir-382促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖

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解剖学报 2018年第4期49卷 437-442页

作者：高航张春艳王凤娟徐存拴河南师范大学生命科学学院河南省·科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地河南新乡453007 太康县第一高级中学河南太康461400

目的探讨mir-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法 BRL-3A细胞瞬时转染mir-382的模拟物和抑制物48 h,MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况。结果在大鼠BRL-3A细... 详细信息

目的探讨mir-382对大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖和凋亡的影响。方法 BRL-3A细胞瞬时转染mir-382的模拟物和抑制物48 h,MTT法测定细胞活性;流式细胞术检测细胞周期;Real-time PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况。结果在大鼠BRL-3A细胞中,转染模拟物可以显著增加mir-382的表达,转染抑制物可以显著降低mir-382的表达(Pmir-382过表达后,BRL-3A细胞活性明显提高;流式细胞术检测表明,mir-382过表达组S期的细胞数明显增加,而mir-382干涉组S期的细胞数明显减少;用Real-time PCR检测细胞增殖/凋亡相关基因mRNA表达水平表明,mir-382过表达后,BRL-3A细胞增殖相关基因增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Ccnd1的mRNA表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bax的mRNA表达水平下调,而mir-382干涉组与上述结果相反。结论 mir-382通过促进细胞增殖相关基因表达,抑制细胞凋亡相关基因表达而促进大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖。

关键词： mir-382 BRL-3A细胞细胞周期细胞增殖实时定量聚合酶链反应大鼠

mir-382对γδ T细胞杀伤肺癌细胞活性的影响及机制研究

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中国现代应用药学 2018年第1期35卷 24-28页

作者：李杰宁波市第二医院胸外科浙江宁波315010

目的探讨γδ T细胞对肺癌细胞系A549的杀伤活性,并研究mir-382在其中发挥的作用。方法采用流式细胞术鉴别γδ T细胞LDH释放实验检测γδ T细胞和mir-382对A549的杀伤活性。荧光定量PCR检测mir-382在肺癌细胞系A549中的表达情况,Wester... 详细信息

目的探讨γδ T细胞对肺癌细胞系A549的杀伤活性,并研究mir-382在其中发挥的作用。方法采用流式细胞术鉴别γδ T细胞LDH释放实验检测γδ T细胞和mir-382对A549的杀伤活性。荧光定量PCR检测mir-382在肺癌细胞系A549中的表达情况,Western blot法检测mir-382对c-FLIP表达的影响。Western blot试验检测mir-382及γδ T细胞处理后A549细胞Smac/DIABLO和细胞色素C的释放及caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化。结果 mir-382处理能显著增强γδ T细胞对A549的杀伤活性,增强γδ T细胞对A549细胞caspase-8、caspase-9和caspase-3的活化及细胞色素C和Smac/DIABLO的释放,下调A549细胞中c-FLIP蛋白的表达。转染c-FLIP质粒能显著抑制mir-382对γδ T细胞的协同效应。结论 Mi R-382通过下调肺癌细胞中c-FLIP的表达来增强γδ T细胞对其的杀伤活性。

关键词： mir-382 c-FLIP γδ T细胞肺癌 caspase-8

mir-382对大鼠肝细胞株BRL-3A增殖的作用研究

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miR-382对大鼠肝细胞株BRL-3A增殖的作用研究

作者：高航河南师范大学

学位级别：硕士

肝脏是一种具备极强独特再生能力的的器官,正常的情况下是处于静止的状态,很少会增殖,当肝脏出现损伤或部分肝切除(partial hepatectomy,PH),会立即诱发和启动肝细胞增殖和肝脏再生过程,恢复其原有体积、重量和功能。深入研究肝再生的... 详细信息

肝脏是一种具备极强独特再生能力的的器官,正常的情况下是处于静止的状态,很少会增殖,当肝脏出现损伤或部分肝切除(partial hepatectomy,PH),会立即诱发和启动肝细胞增殖和肝脏再生过程,恢复其原有体积、重量和功能。深入研究肝再生的分子机制,对于揭示肝病的发病机理和开发治疗肝病的药物,均具有重要的指导意义。mirNA是在进化上高度保守的具有发夹结构的长约22nt的单链非编码小RNAs,却对细胞增殖、分化、凋亡、生长等重要的细胞生命活动起调控作用,与其靶基因mRNA的3’-UTR序列以碱基互补配对方式发生结合,减弱mRNA的转录后翻译能力或直接降解该mRNA,从而能够通过转录后水平来调控基因的表达,影响细胞的生理生化活动。我们先前的研究表明mir-382在大鼠再生肝中差异表达,是大鼠肝再生相关的mirNA。目前,人们对其调控大鼠肝细胞增殖分子机制尚未见报道。因此,本文主要通过转染mir-382 mimic和inhibitor,过表达和干涉mir-382的表达,检测其对大鼠肝细胞BRL-3A增殖作用的调控,以阐明mir-382在残肝恢复过程中对肝细胞增殖的调控机理。采用MTT和EdU法检测细胞活性和增殖调控机理,结果表明,mir-382过表达后促进BRL-3A细胞的生长,mir-382下调表达后抑制BRL-3A细胞的生长;流式细胞术检测表明,mir-382过表达组与NC组对比,S期的细胞数明显升高,而mir-382干涉组与NC组对比,S期的细胞数明显降低;通过mRNA和蛋白水平分析PTEN-AKT信号通路相关基因/蛋白的表达,RT-PCR和Western blot检测表明mir-382过表达后PTEN显著下调表达,P-AKT上调表达,且细胞增殖相关基因Myc、Bcl2和Ccnd1的mRNA和蛋白表达水平上调,细胞凋亡相关基因Caspase3和Bax的mRNA和蛋白表达水平下调,而mir-382干涉组与上述结果相反。因此,我们推测mir-382可能通过靶向抑制PTEN的表达,进而促进大鼠肝细胞BRL-3A的增殖且有促进肝脏再生和修复的潜能。

关键词： mir-382 BRL-3A细胞细胞周期细胞增殖细胞凋亡

mir-382靶向Kmt5a基因调控精原细胞增殖的研究

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miR-382靶向Kmt5a基因调控精原细胞增殖的研究

作者：朱晋生西北农林科技大学

学位级别：硕士

mirNA是一类具有调控作用的非编码小RNA,它通过与靶基因mRNA的3’UTR区结合调控基因的表达。已有研究表明mir-382参与调控多种细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的侵袭。为了探究mir-382对小鼠精原细胞的增殖调控作用,本研究使用生物信息学预测了... 详细信息

mirNA是一类具有调控作用的非编码小RNA,它通过与靶基因mRNA的3’UTR区结合调控基因的表达。已有研究表明mir-382参与调控多种细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的侵袭。为了探究mir-382对小鼠精原细胞的增殖调控作用,本研究使用生物信息学预测了mir-382-5p的潜在靶基因,并使用双荧光素酶报告系统进行验证;通过转染mir-382-5p的类似物与阻抑物,使用CCK-8与EdU试验检测了mi R-382-5p对小鼠精原细胞的细胞活力与增殖能力的影响;通过RT-qPCR检测了猪睾丸中Kmt5a基因在不同发育阶段与不同细胞类型中的表达情况;使用分子克隆测序与生物信息学分析探究了Kmt5a基因剪接变体的分子结构差异。主要结果如下:1、mir-382-5p的预测靶基因为Kmt5a、Top1,通过双荧光素酶试验证明了Kmt5a是mir-382-5p的一个靶基因,而Top1不是。2、细胞活力与增殖能力检测结果表明,与对照组相比,mir-382-5p mimics在120nmol/L的条件下能降低GC-1 spg细胞的活力13.4%（p＜0.05）,并降低GC-1 spg细胞的增殖能力8.6%（p＜0.05）,而mir-382-5p inhibitor不能显著提高GC-1 spg细胞的活力和增殖能力（p＞0.05）。3、RT-qPCR与Western Blotting试验表明,mir-382-5p mimics在120 nmol/L的条件下能下调靶基因Kmt5a在GC-1spg细胞中的mRNA相对含量39.8%（p＜0.05）,下调KMT5A蛋白表达量36.5%。4、Kmt5a在7日龄猪睾丸支持细胞中的mRNA表达量显著高于间质细胞和性原细胞（p＜0.05）,在5月龄猪睾丸中相对含量显著高于7日龄与2月龄（p＜0.05）。5、DNA测序结果表明Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,即Kmt5a-X1,Kmt5a-X2,蛋白二维结构分析表明KMT5A-X1缺少N端的PIP（PCNA-interacting motifs）box1。综上所述,本研究发现Kmt5a基因是mir-382-5p的一个靶基因,mir-382-5p能够调控GC-1 spg细胞的增殖。因此,mir-382靶向Kmt5a基因调控小鼠精原细胞的增殖。同时,在不同发育阶段的猪睾丸中,Kmt5a的表达量随着年龄的增加而上升;Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,其中剪接变体KMT5A-X1缺少N端的PIP box1。本研究结果丰富了mirNA在精原细胞增殖过程中的调控网络,为进一步解析雄性动物精子发生提供初步的实验依据。

关键词： mir-382 GC-1 spg 增殖精原细胞 Kmt5a

mir-382在小鼠腭板发生过程中的作用机制研究

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miR-382在小鼠腭板发生过程中的作用机制研究

作者：陈勇龙杭州师范大学

学位级别：硕士

唇腭裂是哺乳动物类先天性遗传病之一,在我国每700人中就有1人患有此病,属高发病。目前,公认的致病机制有有两方面环境因素和遗传因素,大多数的唇腭裂是由遗传因素导致。例如,Sox11基因的突变导致小鼠舌头异常进而使得腭板不能正常发育... 详细信息

唇腭裂是哺乳动物类先天性遗传病之一,在我国每700人中就有1人患有此病,属高发病。目前,公认的致病机制有有两方面环境因素和遗传因素,大多数的唇腭裂是由遗传因素导致。例如,Sox11基因的突变导致小鼠舌头异常进而使得腭板不能正常发育,以至导致唇/腭裂的产生。因此,阐明唇腭裂的发病机制将会促进唇腭裂的诊断和修复。哺乳动物类的腭板发育进程受到严格的分子调控,包括细胞增殖、凋亡、迁移以及细胞类型的转化等。在腭板融合时期涉及到腭板间充质细胞的增殖凋亡及迁移,某些基因翻译活性受抑制,这时期mRNA翻译活性受到抑制主要是转录后调控机制调控,而大部分基因转录后翻译抑制受microRNA调控。我们研究组已验证mir-382在小鼠融合时期表达量显著下调,本论文的目的就是要阐明mir-382在小鼠腭板发育过程中分子机制。我们研究发现当mir-382在腭板间充质细胞过表达后,Porcn蛋白表达明显下调,通过抑制Porcn(Porcupine)介导促进细胞的迁移,导致下游基因经典Wnt通路家族基因如Wnt1、Wnt3和Wnt6等的下调。mir-382异常表达可能导致腭板发育异常。综上所述,mir-382通过调控porcn基因调节经典Wnt通路家族基因的表达,进一步影响细胞的功能。

关键词： mir-382 Porcn 腭板发育腭裂

利用肾系膜细胞3D培养体系探讨高糖环境下mir-382与肾纤维化的相关性

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中国临床解剖学杂志 2020年第1期38卷 45-50,56页

作者：李想杨志峰王国保南方医科大学附属南方医院肾内科广州510515 郑州大学第五附属医院全科医学科郑州450052

目的采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究mir-382在糖尿病肾病系膜病变及肾纤维化中的作用。方法采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究不同葡萄糖浓度对肾系膜细胞的影响及mir-382在其中的作用。实验组分为3组(葡萄糖浓度分别设... 详细信息

目的采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究mir-382在糖尿病肾病系膜病变及肾纤维化中的作用。方法采用LBL技术构建肾系膜细胞3D细胞球,研究不同葡萄糖浓度对肾系膜细胞的影响及mir-382在其中的作用。实验组分为3组(葡萄糖浓度分别设为5.6 mmol/L、25 mmol/L、40mmol/L),采用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光等手段检测各组细胞中转化生长因子(TGF-β1)、纤连蛋白(Fn)的表达,mir-382及其可能的靶基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)的水平。结果高糖可使系膜细胞mir-382表达上调,分泌PTEN减少,TGF-β1、Fn表达显著增加。结论mir-382可能通过负向调控PTEN的表达,参与糖尿病肾病早期系膜病变及肾纤维化过程。

关键词： LBL 3D 高糖 mir-382 肾纤维化

利用单细胞层层组装技术构建3D缺氧微环境研究mir-382和细胞自噬在肾纤维化中的作用

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利用单细胞层层组装技术构建3D缺氧微环境研究miR-382和细胞自噬...

作者：杨志峰南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景肾纤维化,包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,是慢性肾脏病的普遍特征。许多病理因素,例如慢性持续感染,缺氧,控制不佳的高血压和糖尿病等,均可以引发进行性和不可逆的肾纤维化。其中糖尿病肾病(DN)主要表现为肾小球硬化,其发... 详细信息

研究背景肾纤维化,包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,是慢性肾脏病的普遍特征。许多病理因素,例如慢性持续感染,缺氧,控制不佳的高血压和糖尿病等,均可以引发进行性和不可逆的肾纤维化。其中糖尿病肾病(DN)主要表现为肾小球硬化,其发病机制目前尚不完全明确。高血糖、遗传背景、血流动力学异常等因素均能引起代谢改变、血管活性物质异常,无法精确解析肾纤维化的发生发展过程。因此,积极探索肾纤维化的相关发病机制,并据此研发新的治疗策略一直是研究者努力的目标与方向,其中,缺氧被认为是一个关键因素。最近的研究已经强调了肾内低氧作为慢性肾脏疾病的一个潜在机制。本研究采用单细胞层层组装技术(LBL)成功地构建了体外3D缺氧微环境,以研究mir-382和细胞自噬在肾纤维化中的作用。目的1、基于单细胞LBL技术平台,构建肾系膜细胞的3D缺氧微环境培养体系。2、明确缺氧微环境对肾系膜细胞mir-382以及相关信号通路的影响。3、明确mir-382诱导肾纤维化的相关机制。内容和方法1、利用单细胞LBL组织工程手段构建肾系膜细胞的3D缺氧微环境培养体系。2、采用qRT-PCR法和免疫荧光分析比较研究在2D、3D培养条件下,缺氧微环境对肾系膜细胞mir-382水平及相关信号通路中各种信号分子表达的影响。3、采用免疫荧光和蛋白质印迹分析(westernblotting)比较研究在2D、3D培养条件下,缺氧刺激对肾系膜细胞纤维化的影响,以及mir-382在肾纤维化中所扮演的角色。4、统计学分析采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,结果用均数±标准差(Mean±SD)来表示。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时的组间比较采用Tukey法,方差不齐时组间比较采用Dunnett’sT3法,pmir-382的高表达,通过下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)的表达导致了肾小球硬化。3、在3D细胞(3D球体内细胞)和3DM细胞(从3D球体迁移的细胞)中检测到了细胞自噬的存在。与3D细胞不同,3DM细胞中TGF-β1和纤维连接蛋白(Fn)表达降低,这证明了细胞自噬在肾纤维化中的肾脏保护作用。4、3DM细胞中CD24+细胞的比例增加,我们推测,通过自噬过程存活下来的细胞可能通过去分化获得了祖细胞的一些特征。结论本文通过对透明质酸(HA)的改性,在乙二胺(EDA)和EDC交联的作用下成功合成了带有正电荷的HA-EDA。我们使用带有正电荷的HA-EDA和带有负电荷的HA,通过LBL在单个肾系膜细胞表面形成了超薄膜。这些经过层层组装的单细胞在用胰蛋白酶处理后形成了 3D RMCs多细胞球体。相关实验结果表明,通过这种LBL/胰蛋白酶处理的方法我们成功构建了体外3D缺氧微环境。同时,本研究发现3D球体中的缺氧微环境诱导了肾系膜细胞中TGF-βl和mir-382的高表达,随后通过下调PTEN的表达导致了肾小球硬化。这种LBL组装球体为我们提供了一种灵活而实用的方法来构建缺氧微环境,以研究缺氧对肾纤维化的作用和机制。基于我们开发的3D RMCs多细胞球体,我们还惊奇地发现一些通过自噬、缺氧微环境存活下来的细胞经历了去分化并获得了一些祖细胞的特征。

关键词： LBL 缺氧 mir-382 细胞自噬肾纤维化

mir-21、mir-182、mir-382在非小细胞肺癌中的临床意义及益气除痰法的干预作用

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广州中医药大学学报 2021年第3期38卷 548-555页

作者：孙玲玲乔靖伍家鸣林丽珠广州中医药大学第一附属医院广东广州510405

【目的】分析mir-21、mir-182、mir-382基因对肺癌进展的影响及益气除痰法的干预作用。【方法】应用生存分析在线软件Kaplan-Meier plotter分析mir-21、mir-182、mir-382对肺癌预后的影响,应用功能富集分析工具FunRich数据库对mir-21、m... 详细信息

【目的】分析mir-21、mir-182、mir-382基因对肺癌进展的影响及益气除痰法的干预作用。【方法】应用生存分析在线软件Kaplan-Meier plotter分析mir-21、mir-182、mir-382对肺癌预后的影响,应用功能富集分析工具FunRich数据库对mir-21、mir-182、mir-382进行功能富集、通路富集分析,GeneMANIA数据库分析靶基因蛋白的互作网络。选取单纯中药治疗中晚期非小细胞肺癌患者(设为“中医组”)和中药联合维持化疗的中晚期非小细胞肺癌患者(设为“结合组”),采用定量聚合酶链反应(PCR)方法分析益气除痰法对患者外周血中mir-21、mir-182、mir-382表达的影响。【结果】mir-21、mir-382的表达量与肺腺癌的生存期呈负相关,与肺鳞癌的生存期关系不明显。mir-182的表达量与肺腺癌患者的生存期无明显相关性,与肺鳞癌的生存期呈正相关。mir-21、mir-182、mir-382靶基因的功能主要为信号传导、细胞之间的通讯,所涉及的信号通路主要包括:整合素家族信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFR)通路及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)通路等。mir-21与肿瘤转移密切相关的靶基因包括:RECK、TNFRSF11B、TGFBI、PDCD4、SPRY2、FOXF2。中医组mir-21的增加水平较结合组低。【结论】mir-21可能影响肿瘤转移及肺腺癌的生存,益气除痰法可能通过调控mir-21的表达有效治疗中晚期非小细胞肺癌。

关键词：益气除痰法肺癌 mir-21 mir-182 mir-382 生存