miR-382靶向Kmt5a基因调控精原细胞增殖的研究

作     者：朱晋生 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾文先

授予年度：2017年

学科分类：08[工学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 0836[工学-生物工程] 090501[农学-动物遗传育种与繁殖] 

主      题：miR-382 GC-1 spg 增殖 精原细胞 Kmt5a 

摘      要：miRNA是一类具有调控作用的非编码小RNA,它通过与靶基因mRNA的3’UTR区结合调控基因的表达。已有研究表明miR-382参与调控多种细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的侵袭。为了探究miR-382对小鼠精原细胞的增殖调控作用,本研究使用生物信息学预测了miR-382-5p的潜在靶基因,并使用双荧光素酶报告系统进行验证;通过转染miR-382-5p的类似物与阻抑物,使用CCK-8与EdU试验检测了mi R-382-5p对小鼠精原细胞的细胞活力与增殖能力的影响;通过RT-qPCR检测了猪睾丸中Kmt5a基因在不同发育阶段与不同细胞类型中的表达情况;使用分子克隆测序与生物信息学分析探究了Kmt5a基因剪接变体的分子结构差异。主要结果如下:1、miR-382-5p的预测靶基因为Kmt5a、Top1,通过双荧光素酶试验证明了Kmt5a是miR-382-5p的一个靶基因,而Top1不是。2、细胞活力与增殖能力检测结果表明,与对照组相比,miR-382-5p mimics在120nmol/L的条件下能降低GC-1 spg细胞的活力13.4%（p0.05）,并降低GC-1 spg细胞的增殖能力8.6%（p0.05）,而miR-382-5p inhibitor不能显著提高GC-1 spg细胞的活力和增殖能力（p0.05）。3、RT-qPCR与Western Blotting试验表明,miR-382-5p mimics在120 nmol/L的条件下能下调靶基因Kmt5a在GC-1spg细胞中的mRNA相对含量39.8%（p0.05）,下调KMT5A蛋白表达量36.5%。4、Kmt5a在7日龄猪睾丸支持细胞中的mRNA表达量显著高于间质细胞和性原细胞（p0.05）,在5月龄猪睾丸中相对含量显著高于7日龄与2月龄（p0.05）。5、DNA测序结果表明Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,即Kmt5a-X1,Kmt5a-X2,蛋白二维结构分析表明KMT5A-X1缺少N端的PIP（PCNA-interacting motifs）box1。综上所述,本研究发现Kmt5a基因是miR-382-5p的一个靶基因,miR-382-5p能够调控GC-1 spg细胞的增殖。因此,miR-382靶向Kmt5a基因调控小鼠精原细胞的增殖。同时,在不同发育阶段的猪睾丸中,Kmt5a的表达量随着年龄的增加而上升;Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,其中剪接变体KMT5A-X1缺少N端的PIP box1。本研究结果丰富了miRNA在精原细胞增殖过程中的调控网络,为进一步解析雄性动物精子发生提供初步的实验依据。