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mafa逆转录病毒表达载体的构建及其在肝原始细胞中的稳定表达

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第二军医大学学报 2008年第5期29卷 465-468页

作者：金彩霞李文林徐方胡以平第二军医大学基础部细胞生物学教研室上海200433 宁夏医学院医学遗传学与细胞生物学教研室银川750004

目的:构建表达mafa(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A)的逆转录病毒表达载体,并建立稳定表达mafa的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)。方法:通过PCR方法克隆mafa基因全长.将其构建到pBMN—Z—IRES-Neo逆转录病毒载体中获得pBMN—mafa—Neo载体;将该载体导入Phoenix包装细胞系,收集病毒上清并感染LEPCs,筛选稳定表达mafa的LEPCs;RT-PCR方法检测mafa表达对LEPCs分子表型的影响。结杲:成功构建pBMN—mafa-Neo载体,并获得稳定表达mafa基因的肝原始细胞系(LEPCs—mafa)。LEPCs-mafa细胞GK和GLUT2基因表达高于LEPCs。结论:成功获得稳定表达mafa的肝原始细胞系,为研究mafa诱导肝干细胞向胰腺细胞转分化奠定了基础。

关键词： mafa 逆转录病毒载体肝原始细胞系

脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖及PDX-1、mafa表达水平的影响

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中国组织工程研究 2015年第36期19卷 5833-5837页

作者：杜俊文吴韬张坤苏白玉卢彩萍王伟超雷琳郭静霞石家庄市第一医院河北省石家庄市050000

背景:1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征。脐血干细胞具有多分化潜能,在体内外均可以诱导分化为胰岛细胞,发挥出一定的降糖作用。目的:探讨脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖水... 详细信息

背景:1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征。脐血干细胞具有多分化潜能,在体内外均可以诱导分化为胰岛细胞,发挥出一定的降糖作用。目的:探讨脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖水平及胰腺组织PDX-1、Maf A表达的影响。方法:30只SD大鼠随机分为3组,每组10只,治疗组和模型组大鼠建立1型糖尿病模型,造模成功后,治疗组尾静脉一次性注射脐血干细胞,正常组给予相同体积的生理盐水,模型组给予相同体积的脐血干细胞缓冲液。采用口服葡萄糖耐量试验评价大鼠胰岛功能,苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺形态,Western blot和PCR检测胰腺组织PDX-1、Maf A蛋白和m RNA表达。结果与结论:1模型组和治疗组大鼠0,30,60,90 min的血糖值均显著高于正常组,差异均有显著性意义(P0.05)。2模型组胰岛数量出现下降,边界模糊不清,呈不规则形态,治疗组胰岛数量出现一定的减少,但尚维持清晰的结构。3治疗组PDX-1及Maf A表达水平与正常组比较差异无显著性意义(P>0.05),但显著高于模型组(P<0.05)。以上结果表明,脐血干细胞可以显著降低1型糖尿病大鼠的血糖水平,改善胰岛功能及胰腺组织形态,并具有上调PDX-1、Maf A表达的作用。

关键词：干细胞移植脐血干细胞 1型糖尿病 PDX-1 mafa

腺病毒转染mafa诱导人脐带间充质干细胞表达胰腺细胞特异性基因

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中国组织工程研究 2017年第9期21卷 1368-1372页

作者：王鸿武倪萍赖秀蓝冯学永林丽敏马廉汕头大学医学院第二附属医院儿科广东省汕头市515041 汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺肿瘤科广东省汕头市515031 深圳大学妇幼保健院广东省深圳市518118 深圳市坪山新区妇幼保健院广东省深圳市518118

背景:人脐带间充质干细胞经化学药物或共培养等方法诱导后胰岛素分泌量低,转染胰腺发育特异性基因诱导干细胞向成熟β细胞分化是近年来的研究热点。目的:探讨mafa基因转染后人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:腺病毒... 详细信息

背景:人脐带间充质干细胞经化学药物或共培养等方法诱导后胰岛素分泌量低,转染胰腺发育特异性基因诱导干细胞向成熟β细胞分化是近年来的研究热点。目的:探讨mafa基因转染后人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:腺病毒携带外源性β细胞发育的关键转录因子Maf A(Ad-mafa-EGFP),转染入第3代人脐带间充质干细胞,诱导后7 d观察细胞的形态学变化,应用PCR检测细胞中胰腺细胞特异性基因(glucagon、Pdx1、Nkx2.2)的表达。结果与结论:(1)经Ad-Maf A-EGFP转染后,倒置相差显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态未见明显变化;(2)荧光显微镜下观察Ad-mafa-EGFP已进入细胞内;(3)经Ad-mafa-EGFP诱导后,人脐带间充质干细胞中人源性胰腺前体细胞glucagon、Pdx1、Nkx2.2基因表达增高,为人脐带间充质干细胞进一步分化成熟胰腺β细胞提供实验依据。

关键词：脐带间质干细胞 Maf转录因子类胰岛素分泌细胞组织工程干细胞脐带脐血干细胞间充质干细胞 mafa 胰腺前体细胞

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转录因子mafa在胰岛β细胞中的作用

中国生物制品学杂志 2009年第9期22卷 937-940页

作者：黄栋任伟济宁医学院医院内分泌二科山东济宁272029 重庆医科大学附属第一医院内分泌科重庆400016

胰岛素是一种可降低血糖水平的多肽类激素,只在胰岛β细胞中分泌。胰岛素基因的转录由多种转录因子引发。转录因子mafa具有β细胞特异性,其在激活胰岛素基因启动子和产生胰岛素的过程中起重要作用。mafa还可以调节多种在胰岛β细胞中起... 详细信息

胰岛素是一种可降低血糖水平的多肽类激素,只在胰岛β细胞中分泌。胰岛素基因的转录由多种转录因子引发。转录因子mafa具有β细胞特异性,其在激活胰岛素基因启动子和产生胰岛素的过程中起重要作用。mafa还可以调节多种在胰岛β细胞中起作用的蛋白的表达。mafa的丰度由多种因素在转录和翻译等水平进行调节。利用基因工程的方法使非β细胞过度表达mafa等转录因子,建立分泌胰岛素的细胞系,有可能成为糖尿病基因治疗的一个靶点。本文就转录因子mafa的特点、其在胰岛β细胞中的作用、mafa的表达与调节及其与糖尿病的关系作一综述。

关键词： mafa 胰岛素启动子糖尿病基因治疗

mafa和P16在2型糖尿病和糖耐量受损β细胞中差异性表达的研究

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MafA和P16在2型糖尿病和糖耐量受损β细胞中差异性表达的研究

作者：晏华福建医科大学

学位级别：硕士

目的:研究Maf A和P16在T2DM和IGTβ细胞中的表达是否存在差异。方法:1.建立动物模型将72只雄性ICR小鼠随机分为3组:ND组、IGT组和T2DM组。ND组以普通饲料饲养,IGT组以高脂饲料饲养。对ND组和IGT组小鼠进行OGTT,葡萄糖剂量为2g/kg,测量0... 详细信息

目的:研究Maf A和P16在T2DM和IGTβ细胞中的表达是否存在差异。方法:1.建立动物模型将72只雄性ICR小鼠随机分为3组:ND组、IGT组和T2DM组。ND组以普通饲料饲养,IGT组以高脂饲料饲养。对ND组和IGT组小鼠进行OGTT,葡萄糖剂量为2g/kg,测量0min、15min、30min、60min和120min时的血糖值,绘制糖耐量曲线。T2DM组小鼠先以高脂饲料饲养4周,然后分两次腹腔小剂量注射STZ,首次注射STZ剂量为70 mg/kg,第二次给药为50 mg/kg。以随机血糖值>16.7mmol/L,并出现“三多一少（多食、多饮、多尿,体重降低）”的症状作为诊断T2DM小鼠的标准。2.免疫组化双染分离三组小鼠胰腺,制备胰腺切片。检测三组小鼠β细胞中Maf A和P16的表达,是通过分别进行抗insulin+抗Maf A和抗insulin+抗P16免疫双染。Insulin由DAB显色剂标记,显微镜下为棕黄色。Maf A和P16由AP-Red显色剂标记,镜下为红色。显微镜下计数三组小鼠β细胞总数以及Maf A和P16免疫阳性细胞数。应用统计学软件分析Maf A和P16在T2DM小鼠、IGT小鼠和ND小鼠β细胞中的表达率。结果:1.动物模型OGTT:IGT组小鼠在30min、60min和120min时的血糖值明显高于ND组,其差异有统计学意义（P<0.05）,这表明IGT组小鼠发生糖耐量受损。T2DM组:21只小鼠随机血糖值高于16.7mmol/L,并出现体重降低、多食、多饮和多尿的症状。2.免疫组化双染ND组、IGT组和T2DM组小鼠Maf A的表达率分别为26.51%4.15%,25.23%9.75%,3.94%.22%,P16的表达率分别为3.52%.84%,3.61%.01%,9.03%.71%。T2DM组β细胞中Maf A表达率低于IGT组和ND组,其差异有统计学意义（P<0.05）。T2DM组β细胞中P16表达率高于IGT组和ND组,差异具有统计学意义（P<0.05）;IGT组与ND组β细胞中Maf A表达率的差异不具有统计学意义（P=0.063）,P16表达率的差异不具有统计学意义（P=0.294）。结论:Maf A和P16在T2DM小鼠和IGT小鼠β细胞中的表达存在差异。T2DM小鼠β细胞中Maf A的表达率明显低于IGT小鼠,P16的表达率明显高于IGT小鼠。

关键词： T2DM IGT mafa P16

mafa基因表达调节剂筛选模型的建立及小分子化合物激活剂的筛选

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MafA基因表达调节剂筛选模型的建立及小分子化合物激活剂的筛选

作者：吴艳楠东北师范大学

学位级别：硕士

糖尿病是慢性代谢性疾病,它的基本特征就是人身体的血糖值升高。近年来,其患病人群逐年递增,已成为世界范围内的一个严重的健康问题。随着病情的发展,患者体内的胰岛β细胞的功能持续降低、数量也会慢慢减少,进而引发高血糖的不断加重... 详细信息

糖尿病是慢性代谢性疾病,它的基本特征就是人身体的血糖值升高。近年来,其患病人群逐年递增,已成为世界范围内的一个严重的健康问题。随着病情的发展,患者体内的胰岛β细胞的功能持续降低、数量也会慢慢减少,进而引发高血糖的不断加重。目前,增强β细胞功能或增加有功能的β细胞数量仍是治疗糖尿病的重要手段,亦是研发糖尿病治疗药物的主攻方向。其中,β细胞替代疗法,被认为是治疗糖尿病的直接而有效的手段,然而它的应用被有限的β细胞来源严重掣肘。近几年,由干细胞诱导产生胰岛β细胞成为备受关注的重要途径,但诱导的效率和质量还有待提高,诱导过程也需要优化。因此,开发新的高效诱导剂,建立更简单有效的诱导方法,成为该领域的研究重点,亦是未来β细胞替代疗法的广泛应用造福于糖尿病患者的希望所在。胰岛β细胞的发育成熟和功能表现受到一些有序表达的调控因子的严密调控,例如胰十二指肠同源盒基因1(pancreatic and duodenal homeobox factor-1,Pdx1)、肌腱膜纤维肉瘤基因同源物A基因(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A,mafa)、同源盒蛋白6.1(homeobox protein 6.1,Nkx6.1)、神经性分化因子1(neurogenic differentiation factor 1,NeuroD1)等。鉴于此,本实验室拟以Pdx1、mafa、Nkx6.1、NeuroD1为靶点,来筛选有效的可以刺激这些重要调控因子表达的小分子化合物,这将为诱导干细胞分化为成熟β细胞提供有效的诱导剂,亦可能获得可调节胰岛β细胞功能活性的活性成分。本研究主要针对mafa、Nkx6.1和NeuroD1等三个重要的转录因子建立其表达调节剂的筛选模型,并主要对mafa(胰岛β细胞终末分化重要标志物)的表达促进剂进行了化合物筛选及开展了相关研究。所获得的研究结果如下。首先,通过PCR扩增获得mafa、Nkx6.1、NeuroD1三个基因的启动子区域,并连接到pGL3-basic荧光素酶报告载体上,成功构建重组荧光素酶报告载体pGL3-mafa,pGL3-Nkx6.1和pGL3-NeuroD1,通过荧光素酶活性检测证实构建的三个重组报告载体均具有较高的荧光素酶活性,说明我们所钓取的各启动子片段均具有较好的转录活性,可用作建立其表达调节剂的筛选模型。然后,我们应用pGL3-mafa报告载体,通过检测荧光素酶活性,经过初筛和复筛,从实验室的两个小分子化合物库700余种小分子化合物中筛选出了可能激活mafa表达的95号和202号化合物。之后通过RT-q PCR和Western Blot方法在mRNA水平和蛋白质水平上进一步证实95号和202号化合物确实可以促进胰岛β细胞系INS-1细胞中mafa基因的表达。其次,我们发现95号和202号化合物可明显激活INS-1细胞中ERK和AKT信号通路,使细胞中磷酸化ERK和AKT水平增高。通过使用这两个信号通路的抑制剂,进一步证明95号和202号化合物是通过激活ERK和AKT通路来促进mafa基因的表达。最后,我们通过检测胰岛β细胞功能、胰岛β细胞瘤的分化和间充质干细胞向胰岛β样细胞的诱导分化,探究了95号和202号化合物,作为mafa表达促进剂可能具有的生物学作用。ELISA检测结果发现95号和202号化合物可促进葡萄糖刺激下的INS-1细胞的胰岛素分泌;锚定非依赖性克隆形成实验证明95号和202号化合物可明显降低胰腺瘤细胞系RIN-mf5细胞的克隆形成能力,说明化合物处理的胰腺瘤细胞的转化能力下降;而诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的实验表明,在诱导最后步骤添加95号和202号化合物可明显促进胰岛β细胞样细胞团的形成,并伴有β细胞特征性因子如Pdx1,mafa和胰岛素的表达增高。综上所述,本研究成功构建了三个在胰岛β细胞功能和分化过程中发挥重要调节作用的转录因子mafa、Nkx6.1和NeuroD1的表达调节剂筛选模型,并筛选到可刺激mafa表达的小分子化合物95、202,揭示了化合物95和202刺激mafa表达的分子机制和生物学作用,尤其它们在诱导间充质干细胞向β样细胞分化过程中的增强作用,提示其未来可用于由干细胞分化获得胰岛β细胞的诱导过程,具有重要的应用价值和意义。

关键词：糖尿病 mafa 化合物筛选干细胞诱导分化胰岛素分泌

甘薯叶黄酮对糖尿病小鼠胰腺中mafa蛋白表达影响研究

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食品工业 2012年第4期33卷 102-104页

作者：李凤林李青旺耿果霞彭勇李文烨冯彩宁吉林农业科技学院生物工程学院吉林132101 燕山大学环境与化学工程学院秦皇岛610400 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

探讨甘薯叶黄酮(FIBL)对糖尿病小鼠糖mafa蛋白表达的影响。采用链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病(NIDDM)小鼠动物模型,然后将动物分成正常对照组、模型对照组、FIBL低剂量灌胃组、FIBL高剂量灌胃组、罗格列酮灌胃组,药物连续灌胃28 d,检测... 详细信息

探讨甘薯叶黄酮(FIBL)对糖尿病小鼠糖mafa蛋白表达的影响。采用链脲佐菌素(STZ)诱导Ⅱ型糖尿病(NIDDM)小鼠动物模型,然后将动物分成正常对照组、模型对照组、FIBL低剂量灌胃组、FIBL高剂量灌胃组、罗格列酮灌胃组,药物连续灌胃28 d,检测mafa在糖尿病小鼠胰腺表达量的变化。结果表明小鼠胰腺组织mafa蛋白量增加。甘薯叶黄酮能刺激糖尿病小鼠的mafa基因,使其表达量增加,从而达到降血糖的作用。

关键词：甘薯叶黄酮小鼠糖尿病 mafa

胰高血糖素样肽-1对mafa基因敲除鼠的影响

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胰高血糖素样肽-1对MafA基因敲除鼠的影响

作者：李玉婷吉林大学

学位级别：硕士

目的:胰高血糖素样肽-1对mafa基因敲除鼠的影响。材料与方法:取6周龄雄性mafa基因敲除小鼠10只,随机分为2组,每组5只。同种ICR野生型小鼠10只,随机分为2组,每组5只。分别给予胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或生理盐水(50μg/kg体重),日2次,持... 详细信息

目的:胰高血糖素样肽-1对mafa基因敲除鼠的影响。材料与方法:取6周龄雄性mafa基因敲除小鼠10只,随机分为2组,每组5只。同种ICR野生型小鼠10只,随机分为2组,每组5只。分别给予胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或生理盐水(50μg/kg体重),日2次,持续4周。分组情况如下:Maf A基因敲除鼠:mafaGLP-1组、mafa生理盐水组;ICR野生型小鼠:野生GLP-1组、野生生理盐水组。检测各实验组血糖水平和体重变化情况;并通过免疫组织荧光染色切片,统计并分析各组胰岛α细胞和β细胞的数量,计算β/α细胞比值;通过实时荧光定量PCR分析相Pdx-1、Fox O1、胰岛素I及胰岛素II等相关转录因子的变化情况。结果:在缺失mafa基因的情况下,与mafa生理盐水组相比,mafaGLP-1组小鼠的血糖水平明显改善,差异有统计学意义(pmafa基因敲除鼠的血糖水平。2.胰高血糖素样肽-1可降低mafa基因敲除鼠的摄食量及体重。3.推测胰高血糖素样肽-1可能通过诱导PDX-1产生,从而诱导胰岛α细胞转化成为胰岛β细胞转来增加β细胞再生,也可能是通过抑制Fox O1逆转胰岛β细胞去分化状态。

关键词：糖尿病胰高血糖素样肽-1 mafa 胰岛α细胞向β细胞转化

金钗石斛多糖对高糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌及转录因子Pdx1和mafa的影响

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金钗石斛多糖对高糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌及转录因子Pdx1和M...

作者：赵亨遵义医学院

学位级别：硕士

目的：观察金钗石斛多糖对高糖诱导的INS-1细胞增殖及胰岛素分泌的影响和对Ins、Pdx1及mafa mRNA表达的影响。方法：1.将大鼠INS-1细胞分为正常对照组（NC）、高糖作用组（HG）、罗格列酮对照组（ROZ）、金钗石斛多糖低(LD)、中(MD)、... 详细信息

目的：观察金钗石斛多糖对高糖诱导的INS-1细胞增殖及胰岛素分泌的影响和对Ins、Pdx1及mafa mRNA表达的影响。方法：1.将大鼠INS-1细胞分为正常对照组（NC）、高糖作用组（HG）、罗格列酮对照组（ROZ）、金钗石斛多糖低(LD)、中(MD)、高(HG)浓度组，各组分别作用48h后通过CCK-8法检测细胞增殖状况。2.48h后弃去各组原培养液，同时加入高糖培养液孵育1h后提取各组细胞培养液上清，并用酶促化学放大发光法检测各组细胞胰岛素分泌量。***-PCR检测各组细胞Ins、Pdx1及mafa mRNA的表达。结果：1.与正常组相比，高糖作用组细胞增殖率明显较低（Pmafa mRNA表达量降低（P0.05）。结论：金钗石斛多糖能提高较长时间高糖水平下的INS-1的细胞增殖率、还提升胰岛素的分泌量、也增加Ins、Pdx1及mafa mRNA的表达量。

关键词：金钗石斛多糖 INS-1 胰岛素 Pdx1 mafa