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H2O2对人皮肤成纤维细胞衰老标记蛋白30及自噬相关蛋白lc3ⅱ表达的影响

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中华皮肤科杂志 2017年第12期50卷 899-903页

作者：田黎明彭圆胡荣毅程杨姜红浩陈红英田庆均张翀王平湖北中医药大学附属中西医结合医院华中科技大学附属武汉中西医结合医院武汉市第一医院皮肤科武汉430022 湖北中医药大学基础医学院

目的探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老标记蛋白30（SMP30）以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（lc3ⅱ）的影响。方法用150 μmol/L H2O2处理2 ~ 4代NHSF 2 h，构建细胞衰老模型作为H2O2组，而未处理的NHSF作为对照... 详细信息

目的探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老标记蛋白30（SMP30）以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（lc3ⅱ）的影响。方法用150 μmol/L H2O2处理2 ~ 4代NHSF 2 h，构建细胞衰老模型作为H2O2组，而未处理的NHSF作为对照组。细胞衰老β半乳糖苷酶（SA？β？gal）染色法检测衰老细胞比例，间接免疫荧光检测自噬相关蛋白lc3的表达，反转录PCR（RT？PCR）检测SMP30 mRNA的表达，Western印迹法检测SMP30和lc3蛋白的表达。结果 H2O2组NHSF的SA？β？gal染色阳性率（41.70% ± 2.95%）显著高于对照组（3.03% ± 0.25%，t = 22.59，P 〈 0.05）。间接免疫荧光结果显示，H2O2组NHSF lc3阳性率（12.60% ± 1.57%）明显低于对照组（23.67% ± 3.04%，t = 5.61，P 〈 0.05）。Western印迹显示，H2O2组lc3Ⅰ/GAPDH比值（0.40 ± 0.02）与对照组（0.41 ± 0.04）比较差异无统计学意义（P 〉 0.05），而H2O2组lc3ⅱ/GAPDH比值（0.20 ± 0.02）明显低于对照组（0.80 ± 0.03，t = 29.69，P 〈 0.05），且H2O2组lc3ⅱ/lc3Ⅰ比值（0.51 ± 0.03）亦明显低于对照组（1.98 ± 0.23，t = 10.967，P 〈 0.05）。H2O2组SMP30 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16 ± 0.01和0.27 ± 0.02）明显低于对照组（分别为0.35 ± 0.01和0.63 ± 0.02），均P 〈 0.05。结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及lc3ⅱ的表达水平，加速NHSF衰老。

关键词：皮肤衰老过氧化氢成纤维细胞自噬衰老标记蛋白30 lc3ⅱ

苦参碱对宫颈癌SiHa细胞中自噬基因Beclin1和lc3ⅱ表达的影响

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中国临床药理学杂志 2020年第13期36卷 1845-1849页

作者：陈晓红王海琳吴慧芳贺小燕毛燕甘肃省人民医院妇产科兰州甘肃730000

目的探究苦参碱对宫颈癌SiHa细胞的抑制作用以及对自噬基因Beclin1和lc3ⅱ表达的影响。方法用含0(对照组),0.25(仅用于增殖抑制实验),0.50,1.00,2.00和4.00 mg·mL^-1苦参碱的RPMI-1640培养基体外培养宫颈癌SiHa细胞。干预24,48和72 h后... 详细信息

目的探究苦参碱对宫颈癌SiHa细胞的抑制作用以及对自噬基因Beclin1和lc3ⅱ表达的影响。方法用含0(对照组),0.25(仅用于增殖抑制实验),0.50,1.00,2.00和4.00 mg·mL^-1苦参碱的RPMI-1640培养基体外培养宫颈癌SiHa细胞。干预24,48和72 h后,用噻唑蓝法检测细胞的增殖抑制;干预48 h后,用逆转录聚合酶链反应分别检测细胞中Beclin1和lc3ⅱmRNA的表达情况。结果苦参碱能够抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性。干预48 h后,0.50,1.00,2.00,4.00 mg·mL^-1苦参碱组和对照组的抑制率分别为(19.83±2.06)%,(21.31±1.97)%,(48.13±2.96)%,(85.40±1.05)%和(1.02±0.02)%,Beclin1 mRNA分别为(8.41±0.05),(28.63±0.09),(36.79±0.06),(49.22±0.09)和1,lc3ⅱmRNA分别为(2.03±0.04),(3.16±0.03),(4.40±0.02),(5.23±0.06)和1,0.50,1.00,2.00,4.00 mg·mL^-1苦参碱组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均Plc3ⅱ的表达,从而抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖。

关键词：苦参碱 SiHa细胞自噬基因 Beclin1 lc3ⅱ

龟羚帕安丸对帕金森病大鼠中脑黑质病理、Beclin1、P62及lc3ⅱ影响的研究

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中华中医药学刊 2021年第1期39卷 5-7,I0015,I0016,I0017,I0018页

作者：常学辉张良芝李天佛河南中医药大学第二临床医学院河南郑州450002 河南中医药大学基础医学院河南郑州450008 栾川县中医院河南栾川471500

目的观察龟羚帕安丸对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型中脑黑质神经细胞病理及自噬相关蛋白Beclin1、P62、lc3ⅱ表达的影响。方法采用6-羟基多巴(6-OHDA)注射法建立PD大鼠模型,造模成功大鼠随机分为模型对照组、美多芭组、... 详细信息

目的观察龟羚帕安丸对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)大鼠模型中脑黑质神经细胞病理及自噬相关蛋白Beclin1、P62、lc3ⅱ表达的影响。方法采用6-羟基多巴(6-OHDA)注射法建立PD大鼠模型,造模成功大鼠随机分为模型对照组、美多芭组、龟羚帕安丸高、中、低剂量组及假手术对照组,每组10只。对照组、模型组给予等容积生理盐水,其余组给予相应药物灌胃,连续给药30 d。观察各组大鼠中脑黑质病理改变;免疫组化法检测大鼠中脑黑质Beclin1、P62及lc3ⅱ蛋白的表达变化情况。结果模型组神经元细胞出现较为明显的损伤;模型组中脑黑质Beclin1及lc3ⅱ表达降低,P62表达明显升高;各治疗组大鼠神经元损伤情况较模型组有所改善,中脑黑质Beclin1及lc3ⅱ表达明显升高,P62表达明显降低。结论龟羚帕安丸可明显改善神经细胞损伤,作用机制与提高Beclin1及lc3ⅱ表达,降低P62的蓄积,疏通自噬-溶酶体降解途径,提高细胞自噬活性,改善细胞自身稳态有关。

关键词：帕金森病龟羚帕安丸自噬 Beclin1 P62 lc3ⅱ

利拉鲁肽对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞lc3ⅱ、p62表达的影响

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利拉鲁肽对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞LC3Ⅱ、p62表达的影响

作者：刘鑫河北医科大学

学位级别：硕士

目的:通过观察胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽干预体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型,检测细胞自噬相关指标lc3ⅱ、p62的变化,及细胞凋亡情况的变化,探讨利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fa... 详细信息

目的:通过观察胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽干预体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型,检测细胞自噬相关指标lc3ⅱ、p62的变化,及细胞凋亡情况的变化,探讨利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的治疗作用效果及机制。方法:用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养液于体外培养人正常肝细胞-L02细胞,细胞培养基中加入油酸、棕榈酸(2:1)诱导肝脂肪变性,建立NAFLD模型。细胞分组:1)正常对照组;2)NAFLD模型组;3)NAFLD模型组+利拉鲁肽治疗组+高脂培养液组:高脂培养液中加入浓度为10nmol/L利拉鲁肽;4)NAFLD模型组+利拉鲁肽治疗组+正常培养液组:正常培养液中加入浓度为10 nmol/L利拉鲁肽;5)正常组+利拉鲁肽:正常培养液中加入浓度为10 nmol/L利拉鲁肽;各组分别干预48h,收集样品。应用全自动生化仪检测肝细胞中甘油三酯(Triglyceride,TG)的含量及上清中丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)的水平,试剂盒检测丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)含量,采用油红“O”染色法测定细胞内脂滴情况。采用q RT-PCR检测lc3ⅱ、p62 mRNA的表达,Western blot检测微管相关蛋白1-轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,lc3)、真核细胞胞质内调控蛋白P62(sequestosome1,SQSTM1)蛋白表达的变化;采用TUNNEL分析法检测细胞凋亡情况的变化。明确利拉鲁肽改善人肝细胞系NAFLD模型疗效的部分机制。数据分析:所得数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差表示。实验数据均进行正态分布检验及方差齐性检验,对于符合正态分布的采用单因素方差分析(one-way ANOVA),对于不符合正态分布的采用K-W秩和检验,以Plc3ⅱ、p62 mRNA和蛋白表达无明显影响(P>0.05)。2 与正常对照组比较,NAFLD组细胞内脂滴明显增多,TG、ALT、MDA水平升高,SOD水平降低,lc3ⅱmRNA和蛋白表达均降低,p62mRNA蛋白表达增加,凋亡指数增加,差异均有显著性(Plc3ⅱ mRNA和蛋白表达均升高,p62 mRNA蛋白表达减少,凋亡指数下降,差异均有显著性(Plc3ⅱ、p62 mRNA和蛋白表达、细胞凋亡指数水平改变幅度较低,差异均有显著性(P<0.05)。结论:1 在体外成功建立非酒精性脂肪肝的细胞模型;2 GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可减轻肝细胞内脂质沉积,改善肝细胞功能。3 GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可通过增加细胞自噬相关蛋白表达水平,改善细胞脂代谢,维持细胞稳态,减少细胞凋亡,对非酒精性脂肪肝起到治疗作用。

关键词： NAFLD GLP-1 自噬 lc3ⅱ p62 利拉鲁肽

自噬相关基因Beclin1和lc3ⅱ在早期宫颈癌组织中的表达及临床意义

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自噬相关基因Beclin1和LC3Ⅱ在早期宫颈癌组织中的表达及临床意义

作者：潘小虹苏州大学

学位级别：硕士

目的：通过检测宫颈癌和正常宫颈组织中自噬相关基因Beclin1和lc3ⅱ（Microtubule-associated protein11ight chain3）的表达情况，探讨Beclin1和lc3ⅱ在宫颈癌发生发展中的作用，并进一步分析两者在宫颈癌发展中的相互关系。方法... 详细信息

目的：通过检测宫颈癌和正常宫颈组织中自噬相关基因Beclin1和lc3ⅱ（Microtubule-associated protein11ight chain3）的表达情况，探讨Beclin1和lc3ⅱ在宫颈癌发生发展中的作用，并进一步分析两者在宫颈癌发展中的相互关系。方法：采用免疫组织化学染色法，检测Beclin1和lc3ⅱ在50例宫颈癌组织、26例正常宫颈上皮组织中的表达情况。实验组：选取2007年1月-2008年12月在苏州大学附属第二医院进行根治性手术治疗的50例I-Ⅱ期宫颈鳞状细胞癌病例，中位年龄42岁。其中IA2期13例（26%），IB期23例（46%），ⅡA期14例（28%）。对照组：选取同期26例因“子宫肌瘤”或“子宫腺肌症”在我院行全子宫切除术的病例，术后病理证实宫颈正常者，中位年龄43岁。选取上述收集的76例病例的标本，用10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，分别作HE染色和免疫组化染色进行实验。采用免疫组织化学法（非生物素二步法）分别检测Beclin1和lc3ⅱ在宫颈癌和正常宫颈上皮组织中的表达。免疫组织化学结果采用半定量综合分析法。采用SPSS17.0统计软件进行统计。结果： 1、正常宫颈上皮组织和宫颈癌组织中Beclin1的阳性率分别为96.2%和28%。两者表达有统计学意义（P=0.000）。正常宫颈上皮组织和宫颈癌组织中lc3ⅱ的阳性率分别为76.9%和26%。两者表达有统计学意义（P=0.000）。 2、Beclin1、lc3ⅱ表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤分化、FIGO分期、肌层浸润、脉管浸润、淋巴结转移均无显著相关性;单因素分析显示脉管浸润（P=0.0009）、淋巴结转移（P=0.002）和Beclin1（P=0.0341）的表达是影响总生存时间的危险因素。多因素分析显示脉管浸润（P=0.036）、淋巴结转移（P=0.016）是影响总生存时间的独立危险因素。 3、Beclin1与lc3ⅱ的表达无相关性（P=0.329）。结论： 1、Beclin1和lc3ⅱ在宫颈鳞癌中的表达低于在正常宫颈组织中的表达，提示两者可能对宫颈癌的发生发展起作用。 2、Beclin1和lc3ⅱ的表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤分化、FIGO分期、肌层浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移等均无相关性。 3、脉管浸润、淋巴结转移和Beclin1的表达是影响宫颈癌预后的危险因素。 4、Beclin1与lc3ⅱ的表达无相关性。 5、脉管浸润、淋巴结转移是影响宫颈癌预后的独立危险因素。

关键词：宫颈癌自噬 Beclin1 lc3ⅱ 免疫组化预后

SPRED2及lc3ⅱ在肾透明细胞癌中的表达及意义初探

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SPRED2及LC3Ⅱ在肾透明细胞癌中的表达及意义初探

作者：杜江遵义医学院

学位级别：硕士

目的:检测Sprouty相关蛋白(Sprouty-related proteins with EVH1 domain,SPRED2)和微管相关蛋白轻链3 Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3 Ⅱ,lc3ⅱ)在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)患者癌组织中的表达,并分析其表达含量与患者临床病理参数之间的关系,初步探讨其临床意义。方法:收集手术切除后病理确诊正常肾组织10例,cc RCC癌组织50例及癌旁组织35例,石蜡包埋。通过免疫组化方法检测组织中SPRED2和lc3ⅱ蛋白的表达情况,分析二者与临床参数之间的相关性。结果:***2蛋白定位在细胞浆和细胞膜,以细胞膜为主。SPRED2在cc RCC癌(4.16±1.58)及癌旁组织(6.86±2.16)中表达显著上调,其在癌旁组织中的表达水平明显高于癌组织(P0.05)。SPRED2在癌旁组织中的表达水平与患者临床分期(P=0.005)及TNM分期呈负相关(P=0.043),与是否伴有淋巴结转移呈负相关(P=0.009),而与性别、年龄及有无远处转移无相关性(P>0.05)。***3Ⅱ蛋白定位在细胞浆和细胞膜,以细胞膜为主。lc3ⅱ蛋白在cc RCC癌(4.20±1.73)及癌旁组织(6.63±2.12)中高表达,在癌旁组织中的表达水平明显高于癌组织(Plc3ⅱ在cc RCC癌组织及癌旁组织中的表达水平与肿瘤临床分期及TNM分期等临床病理参数无明显相关性(P>0.05)。结论:***2及lc3ⅱ在ccRCC癌及癌旁组织均呈高表达,在癌旁组织中的表达水平明显高于癌组织,二者的表达水平明显高于正常肾组织;***2在癌组织中的表达水平与肿瘤临床分期及TNM分期显著相关,而与患者的性别、年龄、是否淋巴结转移及远处转移等无相关;SPRED2在cc RCC癌旁组织表达水平与肿瘤的临床分期及TNM分期显著相关,与是否无淋巴结转移呈负相关,而与患者性别、年龄及是否远处转移等无相关;***3Ⅱ癌组织及癌旁组织中的表达水平与肿瘤临床分期、TNM分期等临床参数无相关。

关键词：肾透明细胞癌 SPRED2 lc3ⅱ 抑癌蛋白 Sprouty相关蛋白

益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织lc3ⅱ、p62表达的影响

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益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织LC3Ⅱ、p62表达的影响

作者：雷清清山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织lc3ⅱ、p62表达的影响。方法:将40只雄性SD大鼠,随机分为4组,分别为正常组、糖尿病肾病组、益肾胶囊组、白藜芦醇组,每组各10只。益肾胶囊组给予益肾胶囊（0.625g/kg·d）灌胃8周、白藜芦醇组... 详细信息

目的:探讨益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织lc3ⅱ、p62表达的影响。方法:将40只雄性SD大鼠,随机分为4组,分别为正常组、糖尿病肾病组、益肾胶囊组、白藜芦醇组,每组各10只。益肾胶囊组给予益肾胶囊（0.625g/kg·d）灌胃8周、白藜芦醇组给予白藜芦醇（30mg/kg·d）灌胃8周、正常组和糖尿病肾病组每日给予等量生理盐水灌胃8周。观察大鼠一般状态变化,测四组大鼠0、4、8周末时的体重、血糖及24小时尿蛋白;8周末,于大鼠腹主动脉取血,测四组大鼠的肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等相关生化指标。用HE、PAS染色法分别观察肾脏组织病理变化,用免疫组织化学技术检测自噬相关蛋白lc3ⅱ及泛素结合蛋白p62（p62/SQSTMI）的表达变化。结果:（1）与正常组相比,糖尿病肾病组大鼠在8周末的体重明显降低（P＜0.05）;与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组、白藜芦醇组大鼠在8周末体重增加（P＜0.05）。与正常组相比,糖尿病肾病组大鼠在0周、4周、8周末的血糖明显升高（P＜0.05）;与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组、白藜芦醇组的大鼠血糖差异均无统计学意义（P＞0.05）。（2）与正常组相比,糖尿病肾病组大鼠的Scr、BUN、胆固醇、甘油三酯、24小时尿蛋白定量值均有所升高（P＜0.05）;与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组和白藜芦醇组大鼠的Scr、BUN、胆固醇、甘油三酯、24小时尿蛋白定量值均有所下降（P＜0.05）。（3）与正常组相比,糖尿病肾病组大鼠的镜下系膜基质增生较明显,肾小管管腔狭窄,上皮细胞水肿,呈现空泡样变性,足细胞自噬相关蛋白lc3ⅱ表达减少（P＜0.05）,p62表达增多（P＜0.05）;与糖尿病肾病组相比,益肾胶囊组及白藜芦醇组大鼠肾脏组织病理改变明显减轻,镜下系膜基质增生减少,肾小管上皮细胞水肿减轻,但个别肾小管仍有空泡样变性,足细胞自噬相关蛋白lc3ⅱ的表达增加（P＜0.05）,p62表达减少（P＜0.05）。结论:益肾胶囊可能通过改善糖尿病肾病大鼠肾组织的自噬障碍,从而对糖尿病肾病的肾脏发挥保护作用。

关键词：益肾胶囊足细胞 lc3ⅱ p62

益肾汤经结肠透析对慢性肾脏病3-5期患者血清Beclin1、lc3ⅱ影响的研究

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益肾汤经结肠透析对慢性肾脏病3-5期患者血清Beclin1、LC3Ⅱ影响...

作者：乔茜山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨益肾汤经结肠透析对慢性肾脏病3-5期患者血清自噬相关蛋白Beclin1、lc3ⅱ的影响,旨在为临床CKD治疗提供新的思路。方法:收集2018年3月至2019年7月我院门诊及住院部资料完整的CKD3-5期患者185例,根据纳入及排除标准最终选择96例... 详细信息

目的:探讨益肾汤经结肠透析对慢性肾脏病3-5期患者血清自噬相关蛋白Beclin1、lc3ⅱ的影响,旨在为临床CKD治疗提供新的思路。方法:收集2018年3月至2019年7月我院门诊及住院部资料完整的CKD3-5期患者185例,根据纳入及排除标准最终选择96例CKD3-5期患者作为CKD组,同时选取同期我院体检中心的20例健康志愿者作为健康组,然后将CKD组患者随机分为对照组(A组)、结肠透析组(B组)和益肾汤结肠透析组(C组),每组各32例患者。对照组给予内科基础治疗,结肠透析组在对照组的基础上联用结肠透析,益肾汤结肠透析组在结肠透析组基础上联用益肾汤灌肠治疗。结肠透析治疗3次/周,2小时/次,治疗周期为4周。收集健康组的一般资料、实验室指标以及CKD组患者的一般资料、治疗前后的实验室指标,并用酶联免疫吸附法(ELISA)检测健康志愿者及CKD3-5期患者治疗前后血清Beclin1、lc3ⅱ水平。分别进行CKD组与健康组一般资料、生化指标的比较以及对照组、结肠透析组、益肾汤结肠透析组三组间一般资料与治疗前后生化指标的比较。应用统计学方法分析结肠透析联合益肾汤灌肠治疗的疗效。结果:(1)CKD3-5期患者血清Beclin1、lc3ⅱ水平均低于健康志愿者(P3-5期患者治疗前Scr、BUN、UA、ALB、TG、TC、HDL、LD L、Ca、P、PTH、Hb、hsCRP、Beclin1、lc3ⅱ水平差异无统计学意义(P>0.05);(3)三组治疗前后比较:与治疗前相比,对照组治疗后血清Scr、BUN、UA水平较前降低(Plc3ⅱ水平差异无统计学意义(P>0.05);结肠透析组、益肾汤结肠透析组治疗后血清Scr、BUN、UA、hsCRP均较前降低(Plc3ⅱ水平升高(Plc3ⅱ升高(Plc3ⅱ升高(Plc3ⅱ与其他临床指标的相关性分析显示:CKD3-5期患者治疗前hsCRP(r=-0.425,P=36,P=0.021)水平与Beclin1呈负相关,hsCRP(r=-0.404,P=31)与lc3ⅱ呈负相关。结论:益肾汤经结肠透析可以提高CKD3-5期患者血清自噬相关蛋白Beclin1、lc3ⅱ水平,增强患者自噬活性,改善微炎症状态,延缓CKD肾功能的进展。

关键词：慢性肾脏病益肾汤结肠透析 Beclin1 lc3ⅱ

MicroRNA204-5p通过调节lc3ⅱ参与早期糖尿病性视网膜病变的研究

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MicroRNA204-5p通过调节LC3Ⅱ参与早期糖尿病性视网膜病变的研究

作者：徐琰瑛南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一。随着糖尿病患者不断增加,糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)也已成为严重的全球性问题,它占所有失明患者总数的5%。DR是糖尿病最... 详细信息

研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一。随着糖尿病患者不断增加,糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)也已成为严重的全球性问题,它占所有失明患者总数的5%。DR是糖尿病最常见的微血管并发症之一,它的主要特征是视网膜微血管的闭塞和渗出,引发黄斑水肿,缺血缺氧促使视网膜形成新生血管,发生增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR),从而容易使视网膜玻璃体出血,有的进而造成牵拉性视网膜脱离(tractional retinal detachment,TRD),使患者视力严重受损,甚至导致失明。目前,多数研究认为DR发生发展的主要原因是持续高血糖导致的一系列代谢异常,它可以引起视网膜的微血管系统受损,通透性发生改变,血-视网膜屏障遭到破坏。但是严格控制血糖水平并不能完全阻止DR的发生,并且DR具有家族聚集倾向,不同种族糖尿病患者的DR发生率也不相同。由此可见,糖尿病视网膜病变的发病机制十分的复杂,有待进一步研究。自噬是一种对细胞内成分降解再利用的保守进化过程,也是维持细胞稳定的重要过程。自噬在一定条件刺激下,使得衰老和受损的细胞器发生生理周转,从而通过各种不同的信号通路来控制细胞。糖尿病会加重视网膜及其毛细血管细胞中的炎症反应,增加晚期糖基化终产物(AGEs)和氧化应激;大量的证据表明,氧化应激与DR发展中涉及的其他代谢异常之间存在着联系,越来越多的数据强调了活性氧(ROS)在自噬激活中起了关键作用。这为自噬在DR中的研究提供重要线索。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类广泛存在于生物体内,20-25个碱基长度的非编码单链RNA。miR-204是由位于染色体9q21.12上的TRPM3大内含子6表达。研究表明,有microRNA参与糖尿病病程,miR-375和miR-9在胰岛素合成和胰腺细胞释放中具有重要作用;miR-103,miR-107,miR-143,miR-144和miR-145也可以通过调节胰岛素受体通路的几个步骤调节肝脏组织和骨骼肌的外周胰岛素敏感性。在眼部结构中,miR-204参与年龄相关性白内障、糖尿病角膜等疾病的发生和发展。这使得miR-204和自噬成为本研究的切入点,为我们对糖尿病性视网膜病变的分子机制的研究提供了新的视角。目的:测定DR大鼠视网膜中miRNA-204的表达情况,lc3ⅱ蛋白水平,探讨二者间的相互关系及其对于DR发生发展的相关作用及机制。方法:将体重200克左右的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组(control组)和糖尿病性视网膜病变组(DR组)。DR组是按60mg/kg体质量进行腹腔注射STZ,建立DR大鼠模型;control组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为对照。分别于72h、1w、4w、8w测量各组大鼠体质量、血糖等一般生理指标,于10w随机抽样对大鼠视网膜组织进行HE染色,确定DR大鼠模型建立。剔除血糖不达标大鼠,将实验大鼠分为control组、DR0组、DR组、anti-miR组、mimic组,共5组,每组n=10。利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术,对DR大鼠视网膜和control大鼠视网膜分别进行检测,从中了解miRNA-204是否存在差异性表达。利用western blot技术,在蛋白水平检测lc3ⅱ在DR大鼠视网膜中相对于control大鼠视网膜是否有所改变。利用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),将miR204-5p、antimiR204-5p分别包装至病毒载体(AAV-U6-Anti-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP;AAVU6-mimic-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP);将上述AAV载体介导体内表达,使DR大鼠视网膜中差异性表达miR204-5p,再运用western-blot检测DR大鼠视网膜中lc3ⅱ的表达是否有影响。结果:通过qRT-PCR检测大鼠视网膜组织miR-204-5p水平,结果表明,相对于control组大鼠,miR-204-5p在DR组大鼠中的表达显著增高。通过Western blot检测大鼠视网膜组织lc3ⅱ蛋白水平,结果表明,相对于control组大鼠,lc3ⅱ在DR组大鼠中的表达被明显抑制。将AAV载体介导体内表达后,通过qRT-PCR检测大鼠视网膜组织miR-204-5p水平,通过Western blot技术在蛋白水平检测了AAV载体介导miR204-5p在DR大鼠视网膜组织中差异性表达后自噬相关蛋白lc3ⅱ的表达,结果表明,相对于DR组大鼠,anti-miR组大鼠视网膜中lc3ⅱ的表达

关键词：糖尿病性视网膜病变自噬 miRNA204-5p lc3ⅱ