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人乳头瘤病毒6型L1蛋白的原核表达及免疫原性评价

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中国生物制品学杂志 2022年第8期35卷 949-953,959页

作者：贺蕾包小华李相梅周晶莹褚彦飞孙博谷铁军吉林大学生命科学学院吉林长春130012 吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室吉林长春130012 中国人民解放军联勤保障部队第964医院消化内科吉林长春130000 上海瑞宙生物科技有限公司吉林长春130012

目的确定原核表达系统中人类乳头瘤病毒6型(human papillomavirus 6,HPV6)L1蛋白的最佳表达条件,并对HPV6 l1 VlP免疫小鼠后产生的中和抗体水平进行评价。方法将密码子优化的HPV6 l1基因片段与原核表达载体pET30a(+)连接,构建重组表达质... 详细信息

目的确定原核表达系统中人类乳头瘤病毒6型(human papillomavirus 6,HPV6)L1蛋白的最佳表达条件,并对HPV6 l1 VlP免疫小鼠后产生的中和抗体水平进行评价。方法将密码子优化的HPV6 l1基因片段与原核表达载体pET30a(+)连接,构建重组表达质粒pET30a-6l1,在大肠埃希菌中表达HPV6 L1蛋白,并通过添加分子伴侣(TF、GroES-GroEl、DnaK-DnaJ-GrpE)筛选能够增加目的蛋白表达的最佳条件。将表达的HPV6 L1蛋白经密度梯度离心、阳离子交换层析后获得纯化蛋白,对其形态进行表征。将纯化的HPV6 l1 VlP免疫BAlB/c小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠血清中和抗体水平。结果质粒pET30a-6l1经双酶切鉴定证明构建正确;添加TF分子伴侣时HPV6 L1蛋白表达量最高;HPV6 l1 VlP是呈均一的、直径45~65 nm的球状结构,与HPV6天然病毒颗粒的形态、大小相似;HPV6 l1 VlP初次免疫小鼠第8周,血清抗体水平达到峰值,为105以上。结论分子伴侣TF促进了HPV6 L1蛋白的可溶性表达,纯化后的目的蛋白免疫原性良好。本研究为后续各型别HPV L1蛋白表达工艺的探索提供了思路,也为下一步的中试扩大培养奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒6型 L1蛋白大肠埃希菌原核表达分子伴侣中和抗体

噬菌体随机肽库筛选HPV45亚型L1蛋白抗原表位

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郑州大学学报（理学版） 2022年第1期54卷 88-94页

作者：彭亚允栗宁陈玉梅周景明刘红亮祁艳华梁超丁培阳朱习芳王爱萍郑州大学生命科学学院河南郑州450001

高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)可诱发女性宫颈癌,HPV45是HPV主要高危亚型之一,L1蛋白是主要的保护性蛋白。以大肠杆菌表达、纯化获得的重组蛋白SUMO-45 l1作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,... 详细信息

高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)可诱发女性宫颈癌,HPV45是HPV主要高危亚型之一,L1蛋白是主要的保护性蛋白。以大肠杆菌表达、纯化获得的重组蛋白SUMO-45 l1作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,并以单克隆抗体3C11为靶分子,使用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行亲和淘选,三轮筛选后挑选12个与单抗3C11反应较强的克隆进行测序并分析。结果表明,噬菌体所展示的氨基酸序列与HPV45 L1蛋白序列“381VPNTYD386”相同,将其进行肽的合成,并通过斑点-酶联免疫吸附测定(dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ElISA)和间接竞争ElISA鉴定,最终鉴定出单克隆抗体3C11识别的L1蛋白线性表位“381VPNTYD386”。该表位的鉴定,为进一步分析HPV45 L1蛋白的结构和功能关系奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒 L1蛋白单克隆抗体噬菌体展示技术表位

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人乳头瘤病毒16型L1蛋白B细胞表位预测

细胞与分子免疫学杂志 2016年第4期32卷 442-445页

作者：王爱萍蒋敏栗宁张改平祁艳华刘燕凯席宇周景明郑州大学生命科学学院河南郑州450001

目的预测人乳头瘤病毒16型l1（HPV-16 l1）蛋白的B细胞表位。方法先从NCBI的蛋白质数据库中获得HPV-16 L1蛋白的氨基酸序列,再采用DNAStar中的Protean模块分析HPV-16型L1蛋白的二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性以及抗原性,然后结... 详细信息

目的预测人乳头瘤病毒16型l1（HPV-16 l1）蛋白的B细胞表位。方法先从NCBI的蛋白质数据库中获得HPV-16 L1蛋白的氨基酸序列,再采用DNAStar中的Protean模块分析HPV-16型L1蛋白的二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性以及抗原性,然后结合吴玉章等建立的氨基酸抗原性指数方法计算其平均抗原指数（AI）,综合分析上述多个参数,预测其可能的B细胞表位区域,并用在线BlAST进行同源性匹配分析。结果综合分析多个参数,预测得出HPV-16 L1蛋白的B细胞表位可能位于第51～58、87～97、214～220、290～296、335～341、351～366、408～418、430～442和475～496肽段,进一步的同源性匹配分析显示肽段51～58、335～341、351～366、408～418、430～442以及475～496为其B细胞表位优势区域,其中肽段51（PIKKPNNN）58、351（SETTYKNTNFKEYlRH）366、408（PPPGGTlEDTY）418和430（KHTPPAPKEDPlK）442的氨基酸序列为HPV-16型L1蛋白所特有,而肽段475（KAKPKFTlGKRKATPTTSSTST）496与HPV-16 E1蛋白具有同源性、335（DTTRSTN）341的氨基酸序列与很多其他型别的HPV的L1蛋白具有同源性。结论综合多种方案预测得到HPV-16 l1的多个B细胞表位优势区域。

关键词：人乳头瘤病毒 L1蛋白宫颈癌 B细胞表位生物信息学

人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要衣壳蛋白l1的可溶性表达及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2022年第6期38卷 553-558页

作者：陈玉梅栗宁薛明岩周景明祁艳华殷佳佳张雨晴李昱雅王爱萍郑州大学生命科学学院河南郑州450001

目的原核表达获得人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白l1(HPV58 l1)并进行鉴定。方法将HPV58 L1蛋白的重组表达菌pE⁃SUMO⁃58 l1(Bl21)经IPTG进行诱导表达,SDS⁃PAGE及Western blot法鉴定重组SUMO⁃58 L1蛋白的表达情况;经Ni柱纯化获得重组SUMO⁃5... 详细信息

目的原核表达获得人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白l1(HPV58 l1)并进行鉴定。方法将HPV58 L1蛋白的重组表达菌pE⁃SUMO⁃58 l1(Bl21)经IPTG进行诱导表达,SDS⁃PAGE及Western blot法鉴定重组SUMO⁃58 L1蛋白的表达情况;经Ni柱纯化获得重组SUMO⁃58 L1蛋白,经泛素样蛋白酶1(UlP1)酶切去除SUMO标签获得重组HPV58 L1蛋白,红细胞凝集试验(HA)验证HPV58 L1蛋白活性;再将重组HPV58 L1蛋白免疫BAlB/c小鼠,ElISA测定免疫血清效价,间接免疫荧光试验(IFA)检测免疫血清与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白的反应情况。结果重组蛋白SUMO⁃58 l1在大肠杆菌中可溶性表达量较高,其相对分子质量(M_(r))约72000。经Ni⁃NTA亲和纯化后,再用UlP1去除SUMO标签最终得到M_(r)约58000的HPV58 L1蛋白,该重组蛋白具有类似于HPV病毒的凝集小鼠红细胞的血凝活性,其血凝价为1∶16。ElISA测定HPV58 L1蛋白免疫小鼠血清效价最高可达1∶10240,且免疫血清可与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白发生特异反应。结论经大肠杆菌表达系统成功获得了具有血凝活性的重组HPV58 L1蛋白,其免疫血清可用于免疫细胞化学检测真核细胞表达的HPV58 L1蛋白。

关键词：人乳头瘤病58型(HPV58) L1蛋白原核表达间接免疫荧光技术(IFA)

人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2019年第12期32卷 1336-1342页

作者：仝光杰王文伟蔡蓓蓓王蓓胡海涛楼觉人上海生物制品研究所有限责任公司

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VlP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构... 详细信息

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VlP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 l1 VlP菌种。采用15 l发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 l1VlP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 l1 VlP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 l1 VlP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 l1 VlP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 l1 VlP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/l,且可与小鼠抗HPV l1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 l1 VlP在小鼠体内的半数有效剂量(ED50)为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 l1 VlP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒52型 L1蛋白病毒样颗粒毕赤酵母免疫原性

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人乳头瘤病毒51型L1蛋白B细胞表位预测

中国病原生物学杂志 2021年第4期16卷 396-399,405页

作者：叶梦霞李烁杨志平张春林龚权梅冰长江大学第二临床医学院医学检验部湖北荆州434020 长江大学医学部免疫学部

目的对高危型人乳头瘤病毒51型(HPV-51)L1蛋白的B细胞表位进行预测和分析。方法从Swissprot蛋白质数据库中检索HPV51型L1蛋白序列,采用生物信息学软件分析其理化性质、二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性、抗原性等参数,运用ExPASy... 详细信息

目的对高危型人乳头瘤病毒51型(HPV-51)L1蛋白的B细胞表位进行预测和分析。方法从Swissprot蛋白质数据库中检索HPV51型L1蛋白序列,采用生物信息学软件分析其理化性质、二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性、抗原性等参数,运用ExPASy网站的TMPRED和PROTSCAlE软件分析预测其跨膜区域;采用氨基酸抗原性指数方法计算肽段的平均抗原指数(AI),将得到的肽段序列用Protein BlAST进行在线同源性匹配分析。结果 HPV51型L1蛋白由504个氨基酸残基组成,分子质量单位为56.31487 ku,等电点8.38。预测人乳头瘤病毒51型L1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的5-10、51-57、75-96、124-132、138-152、174-185、214-217、230-234、269-286、316-320、336-341、355-360、428-443、475-486、489-497肽段。采用氨基酸抗原性指数方法计算AI,筛选出10条HPV 51型L1蛋白的B细胞优势表位。同源性分析显示75-96、138-152、174-185、428-443区段为可能的HPV51型L1蛋白优势B细胞表位。结论生物信息学方法预测HPV51型L1蛋白含有多个B细胞表位优势区域,可为其表位疫苗的研究提供理论基础。

关键词：人乳头瘤病毒51型(HPV-51) L1蛋白 B细胞表位预测

人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA与L1蛋白联合检测在宫颈癌前病变诊断中的临床价值

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中国妇产科临床杂志 2018年第5期19卷 397-399页

作者：王富伟魏爱婷邱翠河南省漯河医学高等专科学校第三附属医院 462002 河南省濮阳市人民医院

目的探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）E6/E7 mRNA和L1蛋白的联合检测在宫颈癌前病变诊断中的临床价值。方法选择353例HPV感染患者为研究对象,分别采用b-DNA技术检测患者TCT标本中E6/E7 mRNA的阳性表达率,免疫组织化学法检... 详细信息

目的探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）E6/E7 mRNA和L1蛋白的联合检测在宫颈癌前病变诊断中的临床价值。方法选择353例HPV感染患者为研究对象,分别采用b-DNA技术检测患者TCT标本中E6/E7 mRNA的阳性表达率,免疫组织化学法检测患者宫颈石蜡包埋组织标本中L1蛋白阳性表达率。结果 E6/E7 mRNA阳性表达率与宫颈病变严重程度呈正相关（r=0.485,P〈0.001）,L1蛋白阳性表达率与宫颈病变严重程度呈负相关（r=-0.471,P〈0.001）;在诊断CIN2及以上病变（CIN2＋）时,E6/E7 mRNA、HPV L1蛋白单独检测与两者联合检测比较,E6/E7 mRNA检测方法的敏感性和阴性预测值（NPV）均高于其他两种检测方法（均P〈0.05）,而联合检测方法特异性均高于E6/E7 mRNA和L1蛋白检测方法（均P〈0.05）,联合检测方法阳性预测值（PPV）高于L1蛋白检测方法（P〈0.05）。结论 E6/E7 mRNA与L1蛋白方法联合检测在分流HPV感染患者,帮助医生选择合适的治疗方案及疗效评估方面,应具有非常好的临床应用前景。

关键词：宫颈病变人乳头瘤病毒 E6/E7 mRNA L1蛋白

人乳头瘤病毒-16 L1蛋白抗体的制备及应用

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中国生物制品学杂志 2020年第8期33卷 908-911页

作者：刘传志卞文治梁雨萍长春理工大学生命科学技术学院吉林长春130022

目的制备人乳头瘤病毒-16(human papillomavirus type-16,HPV-16)L1蛋白抗体,并验证HPV-16鼠源单抗的特性。方法以HPV-16 L1蛋白分别免疫BAlB/c小鼠及新西兰大耳白兔,制备HPV-16鼠源单抗及兔血清多抗,建立检测HPV-16抗体的双抗夹心ElIS... 详细信息

目的制备人乳头瘤病毒-16(human papillomavirus type-16,HPV-16)L1蛋白抗体,并验证HPV-16鼠源单抗的特性。方法以HPV-16 L1蛋白分别免疫BAlB/c小鼠及新西兰大耳白兔,制备HPV-16鼠源单抗及兔血清多抗,建立检测HPV-16抗体的双抗夹心ElISA方法;鉴定鼠源单抗的特异性、热稳定性,并验证方法的准确性。结果制备的HPV-16鼠源单抗最高效价为5.5×10^6,兔血清多抗效价为2.25×10^7。该鼠源单抗仅与灭活病毒HPV-16呈阳性反应,而与灭活病毒HPV-18、HPV-52及HPV-58无交叉反应,于37℃保存6 d,蛋白稳定性良好;灭活HPV-16浓度在1~50μg/ml范围内时,检测偏差率在5%以内。结论成功制备了HPV-16鼠源单抗,其特异性强,热稳定性良好,建立的双抗夹心ElISA法检测准确,为早期临床HPV筛查及治疗效果评价提供了可能。

关键词：人乳头瘤病毒-16 宫颈癌 L1蛋白单克隆抗体多克隆抗体

人乳头瘤病毒58亚型l1衣壳蛋白的表达纯化及免疫原性分析

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人乳头瘤病毒58亚型L1衣壳蛋白的表达纯化及免疫原性分析

作者：薛明岩郑州大学

学位级别：硕士

宫颈癌是最常见的女性癌症之一,人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)高危亚型(Hight-risk,HR)的长期持续感染是引发女性宫颈癌变的必要条件。HPV是一类ds DNA病毒,衣壳为二十面体球状结构,l1与l2蛋白共同构成了病毒的衣壳,其中l1是... 详细信息

宫颈癌是最常见的女性癌症之一,人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)高危亚型(Hight-risk,HR)的长期持续感染是引发女性宫颈癌变的必要条件。HPV是一类ds DNA病毒,衣壳为二十面体球状结构,l1与l2蛋白共同构成了病毒的衣壳,其中l1是HPV的主要衣壳蛋白。L1蛋白在合适的条件下在体外可以进行自发的组装,5个l1单体蛋白可聚集形成一个五聚体,72个五聚体可以组装成病毒样颗粒,经过VlP免疫刺激的机体可以被诱导产生中和性抗体,是用来制备HPV预防性疫苗的良好平台。目前已获得批准上市的HPV预防性疫苗多是来自昆虫细胞或酵母细胞的基因工程亚单位疫苗,疫苗的制备成本相对较高,在发展中国家和欠发达地区的普及率很低。HPV 58是常见高危亚型之一,且在东亚地区尤其流行,本研究旨在利用原核系统表达可溶的HPV 58L1蛋白,并分析其免疫原性,为HPV广谱预防性疫苗的研制寻找可替代的候选方法。在本研究中,将优化的HPV 58的l1基因序列克隆到pE-SUMO上,构建重组质粒pE-SUMO-l1,之后将pE-SUMO-l1转化DH5α与Bl21(DE3),通过引入SUMO-tag来促进L1蛋白的可溶性。经过优化SUMO-l1的表达条件,最终得到了可溶性表达水平较高的SUMO-L1蛋白。之后切除SUMO-tag验证L1蛋白,L1蛋白在免疫小鼠后采集小鼠的血清,测定小鼠免疫后的血清效价,之后间接免疫荧光实验鉴定免疫血清与真核系统表达的L1蛋白的反应性,为以后针对于HPV广谱预防性疫苗的研制积累经验。本次研究,成功构建了重组表达菌pE-SUMO-58 l1-Bl21(DE3),经探究后,确定了蛋白的最适诱导条件为:菌株在220 r/min、37℃下培养到OD=1.0时,加入IPTG使其浓度为0.6 mmol/l,之后转移至16℃条件下诱导表达14 h,该条件下蛋白表达量约为110 mg/l。SUMO-L1蛋白大部分以可溶形式表达,大小为72 k Da左右。SUMO-L1蛋白采用Ni-NTA柱进行纯化,纯化后的SUMO-L1蛋白与Ulp1蛋白酶反应后去除SUMO-tag最终得到L1蛋白,经过HA验证,其具有与天然病毒类似的血凝活性,血凝价为1:16。L1蛋白免疫Balb/c小鼠后,测定小鼠免疫后的不同时间的血清效价,结果显示,20μg组和5μg组都产生了特异性抗体,在免疫的第36天,20μg组小鼠血清效价可达1:1.024×10,免疫组与PBS组相比都有明显的差异,而20μg组和5μg组的差异并不大。IFA结果显示,经L1蛋白免疫后产生的抗体血清可与真核系统表达的L1蛋白发生反应。以上结果表明,所获得的L1蛋白具有良好的免疫原性,同时也为以后针对于HPV广谱预防性疫苗的研制积累了经验。

关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒 L1蛋白原核表达免疫原性分析