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干扰Hsp70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

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武汉大学学报（医学版） 2010年第4期31卷 426-429,434页

作者：马建鸿李世文罗仪武汉大学中南医院泌尿外科湖北武汉430071

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白Hsp70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对Hsp70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,... 详细信息

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白Hsp70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对Hsp70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后Hsp70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向Hsp70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-Hsp70-21、pGenesil-1-Hsp70-22和pGenesil-1-Hsp70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-Hsp70-23质粒对精原细胞Hsp70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-Hsp70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向Hsp70-2的shRNA重组质粒载体。

关键词： Hsp70-2 RNAi shRNA 串联质粒

中国荷斯坦奶牛Hsp70-2基因的多态性及其与乳腺炎的相关性

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中国荷斯坦奶牛HSP70-2基因的多态性及其与乳腺炎的相关性

作者：黄品安徽师范大学

学位级别：硕士

奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)是世界范围内牛奶产业一项严峻的挑战，即使人们已经对此采取了很多的防治策略，但仍然没有显著地改变这一现状。近些年来hsp70表达，并导致先天免疫的激活越来越受到重视。我们也注意到了hsp70通过抑制NF-... 详细信息

奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)是世界范围内牛奶产业一项严峻的挑战，即使人们已经对此采取了很多的防治策略，但仍然没有显著地改变这一现状。近些年来hsp70表达，并导致先天免疫的激活越来越受到重视。我们也注意到了hsp70通过抑制NF-κB的炎症通路等方式，从而达到调节炎症反应的功能。作为hsp70基因家族的重要成员之一，Hsp70-2基因多态性可能有助于研究动物的易感性乳腺炎症。然而，奶牛Hsp70-2基因多态性与中国荷斯坦奶牛乳腺炎的之间的关系的研究鲜见报道。本研究采用单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对中国荷斯坦奶牛Hsp70-2基因编码区(1to1926)及部分5’及3’侧翼非编码区(-170to0;1927to2127)进行克隆及多态性研究。结果检测到25个SNP位点，包括非编码区检测到12个SNP位点，以及在成熟蛋白质部位发现13个SNP位点。其中等位基因L中的g.1770C→G (590Asp→Glu)和等位基因M中的g.1877G→C (626Gly→Ala)两个位点导致了氨基酸的改变，g.1770C→G导致蛋白质590位点由天冬氨酸转(ASP)为谷氨酸(Glu)，g.1877G→C导致蛋白质626位点由亲水性甘氨酸(626Gly)替换为疏水性丙氨酸(626Ala)，并导致氨基酸二级结构的改变。在所有的检测的103头奶牛中发现3种潜在的蛋白质类型，但是这三种潜在蛋白质类型的三级结构并没有差异。功能位点显示g.1877G→C (626Gly→Ala)使得甘氨酸富集区丢失一个甘氨酸;而与g.1770C→G完全连锁的g.1743G→A, g.1746C→T, g.1761T→G所对应的氨基酸区域出现在酪蛋白激酶II磷酸化位点上。疾病相关性分析显示CC, JL, MO以及MN基因型的发病率明显高于其他基因型，与这些基因型相应的九个SNP位点(g.-115G→A, g.-98T→C, g.117C→A, g.156A→C, g.1743G→A, g.1746C→T, g.1761T→G,g.1770C→G, g.1877G→C)被认为与奶牛乳腺炎易感性相关，并可以作为分子标记用于培育抗乳腺炎中国荷斯坦奶牛品种。

关键词：中国荷斯坦 Hsp70-2 单核苷酸多态性乳腺炎

热应激对小鼠睾丸Hsp70-2基因mRNA转录水平的影响

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安徽农业科学 2008年第36期36卷 15799-15801页

作者：姜忠玲青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109

用半定量RT-PCR方法检测不同温度、相同时间(4 h)热应激处理小鼠睾丸组织中Hsp70-2基因的mRNA转录水平,以研究热应激对Hsp70-2基因mRNA转录的影响。结果显示,各热应激组小鼠睾丸Hsp70-2 mRNA转录水平下降,并且温度越高,其下降幅度越大... 详细信息

用半定量RT-PCR方法检测不同温度、相同时间(4 h)热应激处理小鼠睾丸组织中Hsp70-2基因的mRNA转录水平,以研究热应激对Hsp70-2基因mRNA转录的影响。结果显示,各热应激组小鼠睾丸Hsp70-2 mRNA转录水平下降,并且温度越高,其下降幅度越大。与对照组相比,33℃组小鼠Hsp70-2 mRNA相对转录水平显著(P2℃组下降极显著(P2℃组Hsp70-2 mRNA相对转录水平仅为对照组的44.7%。上述结果说明,热应激使Hsp70-2基因mRNA转录水平下降,热应激对雄性生殖机能的影响与Hsp70-2减少有关,而Hsp70-2 mRNA转录水平可以作为热应激对雄性生殖机能损伤程度的判断指标之一。

关键词：热应激小鼠睾丸 RT-PCR Hsp70-2 mRNA

抑制Hsp70-2基因表达诱导肝癌细胞G_2/M期阻滞的机制研究

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胃肠病学和肝病学杂志 2008年第12期17卷 966-970页

作者：夏丽敏田德安张琼晏维周珍珍朱倩罗敏张全乐华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科湖北武汉430030

目的探讨Hsp70-2在肝癌组织中的表达,以及抑制Hsp70-2表达对肝癌细胞生长和周期影响的详细作用机制。方法免疫组织化学检测Hsp70-2在45例肝癌组织和癌旁组织中的表达,Western blot检测Hsp70-2在5种肝癌细胞株中的表达。设计合成针对hsp7... 详细信息

目的探讨Hsp70-2在肝癌组织中的表达,以及抑制Hsp70-2表达对肝癌细胞生长和周期影响的详细作用机制。方法免疫组织化学检测Hsp70-2在45例肝癌组织和癌旁组织中的表达,Western blot检测Hsp70-2在5种肝癌细胞株中的表达。设计合成针对Hsp70-2基因的特异性shRNA,构建真核表达载体Hsp70-2 shRNA1和Hsp70-2 shRNA2。转染肝癌细胞后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测Hsp70-2表达及细胞周期相关蛋白p-Cdc2(Tyr15)、Cdc25C、Cdc2和cyclinB1的表达变化。结果免疫组织化学检测显示,45例肝癌组织中有33例(73.3%)Hsp70-2蛋白表达阳性,45例癌旁组织中仅4例(8.9%)表达阳性,表达差异有显著性(PHsp70-2蛋白在HepG2、Bel-7402、Huh-7、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞中的表达明显高于其在L02细胞中的表达。Hsp70-2 shRNA1和shRNA2均能有效抑制肝癌细胞HepG2和Bel-7402中Hsp70-2的表达。与control shRNA组相比,转染Hsp70-2 shRNA1和shRNA2组HepG2和Bel-7402细胞生长增殖速度均明显减慢,细胞周期表现为处于G2/M期的细胞比例显著增加。Western blot检测发现,转染Hsp70-2 shRNA1和shRNA2后肝癌细胞中磷酸化的p-Cdc2(Tyr15)表达增加,Cdc25C、Cdc2和cyclinB1表达显著减少。结论Hsp70-2在肝癌中过表达,抑制Hsp70-2表达可以显著抑制肝癌细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞,其诱导G2/M期阻滞的机制是通过影响Cdc25C-Cdc2/cyclinB1通路来实现的。

关键词： Hsp70-2 肝癌 RNA干扰细胞周期

利用GST pull-down联合质谱技术鉴定H7N9禽流感病毒PA-X的互作蛋白

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广东农业科学 2022年第1期49卷 121-127页

作者：徐国双姜童潇郭艺迪段铭张茂林关振宏吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病教育部重点实验室吉林长春130062

【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进... 详细信息

【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白。利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析。【结果】经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质。通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程。对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位。【结论】利用GST pulldown联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础。

关键词：禽流感病毒H7N9 PA-X GST pull-down 质谱 Hsp70-2 蛋白互作

江西汉族人群中热休克蛋白70基因多态性与冠心病的关联性研究

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江西汉族人群中热休克蛋白70基因多态性与冠心病的关联性研究

作者：吴韦南昌大学

学位级别：硕士

研究目的: 探讨hsp70-1(+190G/C)、Hsp70-2(+1267A/C)和hsp70-hom(+2437T/C)在江西汉族人群中的基因分布及其基因多态性与冠心病的相关性。对象及方法：对象：选择2009年1月至2010年12月，在南昌大学第二附属医院心血管内科住院的，... 详细信息

研究目的: 探讨hsp70-1(+190G/C)、Hsp70-2(+1267A/C)和hsp70-hom(+2437T/C)在江西汉族人群中的基因分布及其基因多态性与冠心病的相关性。对象及方法：对象：选择2009年1月至2010年12月，在南昌大学第二附属医院心血管内科住院的，根据冠脉造影结果分两组，冠心病组和正常对照组。①冠心病组：237例，年龄51--77岁，平均63.35±7.77岁，男性152例，女性85例;②正常对照组：203例，年龄50--75岁，平均62.72±9.18岁，男性122例，女性81例。选择的人群均为汉族，籍贯江西，且无血缘关系，并签了知情同意书。入选人群有以下情况均要排除:患有炎症感染、自身免疫性疾病、肿瘤性疾病、肝、肾功能不全及服用任何抗感染药物。冠心病的筛选标准是：经冠状动脉造影证实，其左主干、右冠、左前降支、左回旋支中一支或一支以上狭窄≥50%。正常对照组入选标准是：无胸痛史，心电图正常的或有不典型胸痛，但冠脉造影排除冠心病的住院病人。方法：所选人群均询问一般情况，包括现病史、吸烟史、家族史及称体重、量身高、体格检查等。并对其空腹采取静脉，均测定血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和空腹血糖。另取5ml静脉血置于EDTA-K2抗凝管中，用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，对237例冠心病患者及203例正常人群检测hsp70-1基因+190G/C、Hsp70-2基因+1267A/G、10-4hsp70-hom基因+2437T/C多态性，并分析了各基因型和等位基因分布情况。数据用Hardy-Weinberg吻合度检验、卡方(χ)检验、t检验、Logistic回归等分析，统计分析均采用SPSS19.0统计软件包。实验结果： 1、江西汉族人群中hsp70-1基因+190G/C、 Hsp70-2基因+1267A/G、hsp70-hom基因+2437T/C有多态性。 2、hsp70-1基因的三种基因型GG、GC、CC，Hsp70-2基因的三种基因型GG、AG、GG，hsp70-hom基因的三种基因型TT、TC、CC均符合Hard-Weiberg遗传平衡分布，具有代表性。 3、冠心病组与对照组相比，hsp70-1基因C等位基因、(GC+CC)基因型的频率分布有具有统计学差异(χ=13.781，P＜0.005和χ=12.885,P＜0.005)。 4、同上，两组Hsp70-2基因G等位基因、(AG+GG)基因型的频率分布也具有统计学差异(χ=7.577，0.01＜P＜0.025和χ=7.023，0.005＜P＜0.01)。 5、冠心病组的hsp70-hom基因T等位基因、(TC+CC)基因型的频率与对照组对比无统计学差异(χ=0.343，0.75＜P＜0.9和χ=0.139，0.5＜P＜0.75)。 6、Logistic多元回归分析可知体重指数、吸烟、高血压、TG、LDL-C、GLU、hsp70-1基因(GC+CC)基因型和Hsp70-2基因(AG+GG)基因型可能是冠心病的独立危险因素，而hsp70-hom基因(TC+CC)基因型则不是。结论： 1、hsp70-1基因+190G/C多态性与冠心病的发病有关联，其中(GC+CC)基因型和C等位基因可能是冠心病的独立危险因素。 2、Hsp70-2基因+1267A/G多态性与冠心病的发病有关联，其中(AG+GG)基因型和G等位基因可能是冠心病的独立危险因素。 3、hsp70-hom基因+2437T/C多态性与冠心病的易感性无相关性。

关键词： hsp70-1 Hsp70-2 hsp70-hom 基因多态性冠心病危险因素