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Functional metabolomics reveal the role of AHR/gpr35 mediated kynurenic acid gradient sensing in chemotherapy-induced intestinal damage

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2021年第3期11卷 763-780页

作者： Di Wang Danting Li Yuxin Zhang Jie Chen Ying Zhang Chuyao Liao Siyuan Qin Yuan Tian Zunjian Zhang Fengguo Xu Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance(Ministry of Education) State Key Laboratory of Natural MedicineChina Pharmaceutical UniversityNanjing 210009China Nanjing Drum Tower Hospital the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical SchoolNanjing 210008China

Intestinal toxicity induced by chemotherapeutics has become an important reason for the interruption of therapy and withdrawal of approved agents. In this study, we demonstrated that chemotherapeutics-induced intestinal damage were commonly characterized by the sharp upregulation of tryptophan(Trp)àkynurenine(KYN)àkynurenic acid(KA) axis metabolism. Mechanistically,chemotherapy-induced intestinal damage triggered the formation of an interleukin-6(IL-6)àindoleamine2,3-dioxygenase 1(IDO1)àaryl hydrocarbon receptor(AHR) positive feedback loop, which accelerated kynurenine pathway metabolism in gut. Besides, AHR and G protein-coupled receptor 35(gpr35) negative feedback regulates intestinal damage and inflammation to maintain intestinal integrity and homeostasis through gradually sensing kynurenic acid level in gut and macrophage, respectively. Moreover, based on virtual screening and biological verification, vardenafil and linagliptin as gpr35 and AHR agonists respectively were discovered from 2388 approved drugs. Importantly, the results that vardenafil and linagliptin significantly alleviated chemotherapy-induced intestinal toxicity in vivo suggests that chemotherapeutics combined with the two could be a promising therapeutic strategy for cancer patients in *** work highlights gpr35 and AHR as the guardian of kynurenine pathway metabolism and core component of defense responses against intestinal damage.

关键词： Intestinal toxicity Kynurenine pathway Gradually sensing AHR gpr35

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Spatial multi-omics characterizes gpr35-relevant lipid metabolism signatures across liver zonation in MASLD

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Life Metabolism 2024年第6期3卷 1-16页

作者： Wuxiyar Otkur Yiran Zhang Yirong Li Wenjun Bao Tingze Feng Bo Wu Yaolu Ma Jing Shi Li Wang Shaojun Pei Wen Wang Jixia Wang Yaopeng Zhao Yanfang Liu Xiuling Li Tian Xia Fangjun Wang Di Chen Xinmiao Liang Hai-long Piao Key Laboratory of Phytochemistry and Natural Medicines Dalian Institute of Chemical PhysicsChinese Academy of SciencesDalianLiaoning 116023China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Department of Biochemistry&Molecular Biology School of Life SciencesChina Medical UniversityShenyangLiaoning 110122China Laboratory of High-Resolution Mass Spectrometry Technologies Dalian Institute of Chemical PhysicsChinese Academy of SciencesDalianLiaoning 116023China School of Life Science and Biopharmaceutics Shenyang Pharmaceutical UniversityShengyangLiaoning 110016China

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease(MASLD)is a metabolic disease that can progress to metabolic dysfunction-associated steatohepatitis(MASH),cirrhosis,and *** zonal distribution of biomolecules in the liver is implicated in mediat-ing the disease ***,G-protein-coupled receptor 35(gpr35)has been highlighted to play a role in MASLD,but the precise mechanism is not fully understood,particularly,in a liver-zonal ***,we aimed to identify spatially distributed specific genes and metabolites in different liver zonation that are regulated by gpr35 in MASLD,by combining lipid metabolomics,spatial transcriptomics(ST),and spatial metabolomics(SM).We found that gpr35 influenced lipid accumulation,inflammatory and metabolism-related factors in specific regions,notably affecting the anti-inflammation factor ELF4(E74 like E-twenty six(ETS)tran-scription factor 4),lipid homeostasis key factor CIDEA(cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha(DFFA)-like effector A),and the injury response-related genes SAA1/2/3(serum amyloid A1/2/3),thereby impacting MASLD ***,SM elucidated specific metabolite distributions across different liver regions,such as C10H11N4O7P(3ʹ,5ʹ-cyclic inosine monophosphate(3ʹ,5ʹ-IMP))for the central vein,and this metabolite significantly decreased in the liver zones of gpr35-deficient mice during MASLD *** together,gpr35 regulates hepatocyte damage repair,controls inflammation,and prevents MASLD progression by influencing phospholipid homeostasis and gene expression in a zonal manner.

关键词： gpr35 MASLD liver zonation spatial transcriptomics spatial metabolomics

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炎性肠病易感基因gpr35在肠炎发生发展中的功能研究

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遗传 2021年第2期43卷 169-181,I0002页

作者：郑燕森卓林刚李大力刘明耀华东师范大学生命科学学院生命医学研究所上海调控生物学重点实验室上海200241

炎性肠病在全球范围内发生极其普遍,具有反复发作、难以治愈的特点,也是诱发结直肠癌的高风险因素之一。肠炎的发生与遗传因素密切相关,有报道发现位于gpr35基因座上的多个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点rs4676... 详细信息

炎性肠病在全球范围内发生极其普遍,具有反复发作、难以治愈的特点,也是诱发结直肠癌的高风险因素之一。肠炎的发生与遗传因素密切相关,有报道发现位于gpr35基因座上的多个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点rs4676410、rs3749171和rs3749172与肠炎敏感性高度相关,但是gpr35基因在肠炎的发生发展进程中的功能及相关机制尚没有明确结论。为了研究gpr35在肠炎中的作用,首先通过CRISPR/Cas9技术构建gpr35敲除小鼠,随后利用DSS诱导的肠炎模型评价gpr35在肠炎发生中的作用,发现敲除小鼠在体重变化、DAI评分、肠上皮损伤以及炎性细胞浸润等肠炎相关指标显著低于野生型小鼠。为了研究肠炎相关SNP突变对gpr35活性的影响,首先根据rs3749171和rs3749172SNP位点突变信息构建gpr35-T108M和gpr35-S294R两种突变型受体,其次通过多种gpr35下游信号通路活性测试,发现两种突变均能够增强gpr35受体活性。最后通过Westernblotting分析发现相较于野生型小鼠,gpr35敲除小鼠肠上皮Erk1/2磷酸化水平增加,表明gpr35敲除后可能通过上调Erk1/2信号通路的方式抑制肠炎的发生发展。综上所述,本研究发现人类肠炎易感的rs3749171和rs3749172位点可能通过激活gpr35及下游信号通路的方式促进肠炎的发生发展,为炎性肠病的治疗提供了潜在的药物作用靶点。

关键词： rs3749171 rs3749172 gpr35 肠炎动物模型

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gpr35调控miRNA-548a-3p对乳腺癌细胞生长和增殖的研究

GPR35调控miRNA-548a-3p对乳腺癌细胞生长和增殖的研究

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作者：耿梦丽桂林医学院

学位级别：硕士

目的:探讨gpr35在乳腺癌中的具体作用,探究在乳腺癌细胞中gpr35调控mi RNA-548a-3p对细胞生长和增殖的影响,为后续乳腺癌的相关研究提供理论依据。方法:首先采用免疫组织化学染色方法检测gpr35在人乳腺癌及乳腺囊性增生组织中的表达,探... 详细信息

目的:探讨gpr35在乳腺癌中的具体作用,探究在乳腺癌细胞中gpr35调控mi RNA-548a-3p对细胞生长和增殖的影响,为后续乳腺癌的相关研究提供理论依据。方法:首先采用免疫组织化学染色方法检测gpr35在人乳腺癌及乳腺囊性增生组织中的表达,探讨乳腺癌组织中gpr35的表达与患者年龄、肿瘤直径和淋巴结阳性数等因素的关系。在动物实验中,用人乳腺癌MDA-MB-231细胞株皮下种植于昆明小鼠体内,构建乳腺癌模型,通过体内转染质粒的方法将过表达gpr35的基因序列转入到小鼠乳腺癌组织中,设置过表达gpr35a组、过表达gpr35b组和空载体组,采用q PCR和Western blot检测乳腺癌组织中gpr35的m RNA和蛋白表达,另外检测过表达gpr35后乳腺癌组织中mi RNA-548a-3p的表达变化,最后提取转染成功的乳腺癌组织原代细胞,用MTT法检测过表达gpr35调控mi RNA-548a-3p的变化对乳腺癌细胞生长增殖的作用。在细胞实验中,通过体外转染质粒的方法在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中转入gpr35过表达基因,同样采用q PCR和Western blot检测乳腺癌细胞中gpr35的m RNA和蛋白的表达,另外检测过表达gpr35后乳腺癌细胞中mi RNA-548a-3p的表达变化,最后用MTT法检测过表达gpr35调控mi RNA-548a-3p的变化对乳腺癌细胞生长增殖的影响。数据分析用算术平均数和标准差((?)±s)表示,两组之间的比较用t检验,两组以上的比较用方差分析,Pgpr35在人乳腺癌组织中的表达呈阳性,在乳腺囊性增生组织中表达为阴性,gpr35的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径和淋巴结阳性数有关(Pgpr35 a组和过表达gpr35b组中gpr35的m RNA和蛋白水平明显高于空载组(Pgpr35b组的m RNA和蛋白水平高于过表达gpr35a组(Pgpr35a组和过表达gpr35b组与空载组相比mi RNA-548a-3p的表达水平明显降低(Pgpr35a组较过表达gpr35b组降低更明显(Pgpr35a组和过表达gpr35b组的mi RNA-548a-3p表达水平降低时乳腺癌细胞的增殖能力显著增强(Pgpr35在人乳腺癌组织中呈阳性表达,与乳腺癌临床病理特征及癌变等因素有关,gpr35可能成为乳腺癌研究的重要参考指标。(2)上调gpr35的m RNA和蛋白表达使mi RNA-548a-3p的表达水平显著降低,对乳腺癌细胞的生长和增殖具有促进作用。

关键词：乳腺癌 gpr35 miRNA-548a-3p 细胞增殖

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gpr35对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及周期的影响

GPR35对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及周期的影响

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作者：王菲郑州大学

学位级别：硕士

背景及意义急性髓系白血病(Acutemyeloid leukemia,AML)是最常见的成人急性白血病类型,主要特征是原始细胞的分化障碍,异常增殖及凋亡受阻。AML是具有高度侵袭性和异质性的疾病。以不同程度的贫血、出血及感染等为主要的临床表现。AML... 详细信息

背景及意义急性髓系白血病(Acutemyeloid leukemia,AML)是最常见的成人急性白血病类型,主要特征是原始细胞的分化障碍,异常增殖及凋亡受阻。AML是具有高度侵袭性和异质性的疾病。以不同程度的贫血、出血及感染等为主要的临床表现。AML可以发生于任何年龄段的人群,以中老年人占比居多,并且发病率随着年龄的增加而增加。成年患者诊断该疾病的中位年龄为68岁。纵观历史,该病的预后较差,只有大约40%的年轻患者(≤60岁)存活超过5年。目前,关于AML的具体发病机制尚不完全明确,随着循证医学的发展及科学研究的不断深入,细胞遗传学和分子遗传学异常已经证实在AML的发病和进展中起重要作用,而且对于AML的诊断和预后具有重要的价值。从70年代开始的几十年里,AML最有效的诱导治疗是“3+7”方案,即3天的蒽环类药物+7天的阿糖胞苷化疗。但是“3+7”治疗方案并不能满足患者对预后的需求。自二十一世纪以来,越来越多的靶向药物应用于临床,如FLT-3抑制剂、维奈克拉等。该病诱导化疗的完全缓解率达到70%-80%,但仍有10%-40%的患者诱导缓解失败。即便经过标准治疗达到完全缓解,仍有部分患者会复发。这提示AML还存在我们未知的AML发病机制。G蛋白偶联受体(GPCRs)参与了众多的生理活动和信号调节。经过详尽的科学研究和临床实验已经被FDA批准用于疾病治疗的G蛋白受体已有100多个。GPCRs是药物研发最重要的生物靶标库,有三分之一的药物是通过调节GPCRs发挥作用的。其家族成员G蛋白偶联受体35(G protein-coupled receptor 35,gpr35)在导致疾病进展中有重要作用。该受体与细胞膜上的Na+/K+-ATP酶相互作用,调节糖代谢,促进小鼠炎症性肠病和肠道肿瘤的发生。在诱导社会应激小鼠模型中,gpr35还介导了细胞自噬的发生,参与了炎症微环境的调节。在非小细胞肺癌中,该受体通过改变肿瘤细胞生长的微环境,介导肿瘤细胞的耐药。它与肠道肿瘤、肺癌、糖尿病和心脏病的发生或发展具有显著相关性。该受体在疾病的发生中具有复杂的作用。然而,它是否在AML的发生和进展中起作用尚未可知。了解gpr35在AML中的生物学功能,及其对疾病的影响,有望为AML的治疗提供新的治疗选择。目的检测gpr35在AML患者及健康人群骨髓(Bone Marrow,BM)单个核细胞中的表达量。分析gpr35 mRNA水平与患者无进展生存期(Progression-free survival rate,PFS)及总生存期(overall survival,OS)的关系,评价其用于临床分子诊断的效能及其对预后的影响。利用Mlom13细胞系探索gpr35表达水平改变对细胞周期变化、细胞增殖和凋亡的影响。进一步探索gpr35发挥作用的分子机制,实验研究其对WNT/β-catenin/MYC信号通路的调控能力,分析其在AML发病中可能发挥的分子机制,进而为AML诊疗提供新思路。方法1.使用 TIMER2.0(http://***/)和 GEPIA(http://***/)在线数据库数据检测gpr35在包括AML在内的多种肿瘤中的表达水平;2.荧光定量 PCR(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR,qRT-PCR)技术测定AML患者和正常人骨髓单个核细gpr35的表达水平;3.构建稳定表达gpr35的Molm13细胞系,分别使用CCK-8实验、EdU实验、流式细胞术检测细胞生物表型(增殖、凋亡和周期等)的改变;4.对TCGA数据库中AML患者的转录组数据进行信号通路的GSEA富集分析,筛选可能发挥作用的信号通路;*** blot检测β-catenin/MYC等相关蛋白的表达;6.统计分析:此过程用到的软件包括GraphPad9.0和SPSS 21.0。t-test检验和one-way ANOVA分别适用于两组或多组间的单因素分析检验。生存分析用到Kaplan-Meier法绘制的生存曲线,和log-rank秩和检验方法。采用Cox比例风险模型进行多变量分析,计算风险比(Hazard Ratio,HR)和95%的置信区间(Confidence interval,CI)。当Pgpr35在AML患者骨髓单个核细胞中表达上调;上调了Molm13细胞的gpr35表达后,细胞增殖明显增加,分析细胞周期的结果,发现处于S期的细胞比例增加;上调gpr35对细胞的凋亡没有显著的影响;GSEA富集分析结果提示,AML患者的gpr35 mRNA上调后,WNT/β-catenin/c-Myc通路有意

关键词：急性髓系白血病 G蛋白偶联受体 gpr35 β-catenin

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gpr35调控骨重塑的分子机理研究

GPR35调控骨重塑的分子机理研究

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作者：伍亚蓝华东师范大学

学位级别：硕士

骨质疏松症的特点是骨量减少,骨组织结构被破坏,以致骨结构强度降低、骨骼脆性加剧及骨折概率增加。同时骨质疏松引起的疼痛是与神经系相关的最易发生的慢性疼痛之一。引发骨质疏松及疼痛的原因可解释为骨重塑的动态平衡被破坏,破骨细... 详细信息

骨质疏松症的特点是骨量减少,骨组织结构被破坏,以致骨结构强度降低、骨骼脆性加剧及骨折概率增加。同时骨质疏松引起的疼痛是与神经系相关的最易发生的慢性疼痛之一。引发骨质疏松及疼痛的原因可解释为骨重塑的动态平衡被破坏,破骨细胞异常活化后使其骨吸收速率加快,急剧侵蚀旧骨。这一过程中释放出过多的H+酸化骨微环境并激活两类痛觉感受器TRPV1和ASIC-3,通过背根神经节(DRG)传递疼痛信号到脑部引起疼痛感觉。当今临床上治疗骨质疏松的大部分畅销药物都是通过抑制破骨细胞活性来实现治疗,骨重塑平衡中另一重要环节——成骨细胞的骨形成作用却未被充分考虑,骨质疏松引起的疼痛也得不到缓解甚至还存在很多副作用。gpr35在免疫系统、骨骼系统、背根神经节等表达水平较高,也被报道可以通过TRPV1介导炎症酸性环境引起的疼痛。我们猜测gpr35可能对骨重塑及骨质疏松所引起的疼痛具有重要调控作用。本研究中我们发现,在体外研究中通过激动剂激活gpr35可以抑制体外破骨细胞分化和促进成骨细胞的分化。gpr35缺失对破骨细胞前体细胞增殖无明显影响,却能增强破骨细胞分化、延长成熟破骨细胞存活时间、促进破骨细胞封闭圈形成和融合、加剧骨吸收速率以及抑制间充质干细胞增殖、成骨细胞的分化、矿化能力。体内研究证明敲除gpr35引起破骨细胞活性上升,体内成骨细胞数目、活性及骨生成速率下降,骨组织结构强度下降,从而导致骨量和骨质的整体下降。在卵巢切除模拟的骨质疏松病理条件下敲除gpr35可导致更剧烈的骨质丢失。此外,卵巢切除造成的病理条件下的gpr35敲除小鼠较WT小鼠体内的TRPV1和ASIC-3这两种痛觉受体的表达水平显著上调。对gpr35调控骨重塑的胞内分子机理的初步探究结果指出,gpr35可能通过抑制p65的磷酸化并抑制IκBαα降解负调控破骨细胞活性以及通过强化Wnt/β-catenin信号及上调RUNX2的方式正调控成骨细胞活性。综上所述,gpr35具有成为治疗骨质疏松同时能缓解骨质疏松引起的疼痛的新型药物靶点的潜力。

关键词：破骨细胞成骨细胞 gpr35 骨质疏松骨痛

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gpr35/UCP2在糖脂代谢性心脏损伤中的研究

GPR35/UCP2在糖脂代谢性心脏损伤中的研究

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作者：田玥西南医科大学

学位级别：硕士

目的:1.研究G蛋白偶联受体35(gpr35)在糖脂代谢性心脏损伤中的作用;2.明确解偶联蛋白2(UCP2)是否是gpr35发挥作用的重要靶点;3.探明氧化应激是否是gpr35/UCP2调节糖脂代谢性心脏损伤的内在机制。方法:1.将SPF级C57BL/6健康雄性小鼠随机... 详细信息

目的:1.研究G蛋白偶联受体35(gpr35)在糖脂代谢性心脏损伤中的作用;2.明确解偶联蛋白2(UCP2)是否是gpr35发挥作用的重要靶点;3.探明氧化应激是否是gpr35/UCP2调节糖脂代谢性心脏损伤的内在机制。方法:1.将SPF级C57BL/6健康雄性小鼠随机分为两组:对照组(40只)和实验组(15只)。对照组进食普通饲料3周后,连续腹腔注射柠檬酸钠缓冲溶液(50 mg/kg/d)5天,并持续喂养普通饲料;实验组给予高脂饲料3周后,连续腹腔注射STZ(50 mg/kg/d)5天,并持续喂养高脂饲料。模型构建成功后,(1)测量两组小鼠的体重、空腹血糖,并进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验;(2)检测小鼠血清TG、TC、LDL-c和FFA含量,采用ELISA试剂盒检测血清胰岛素含量;(3)检测血清BNP水平;(4)利用小动物超声检测小鼠心脏舒张功能。(5)利用Masson染色、天狼猩红染色检测心脏纤维化程度;(6)利用透射电镜检测线粒体形态变化;(7)通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot检测gpr35及UCP2的表达水平。2.将成模的小鼠随机分为四组:溶剂组(8只)、gpr35激动剂(Zaprinast)组(8只)、gpr35抑制剂(CID-2745687)组(8只)和UCP2抑制剂(Genipin)组(8只)。(1)采用q RT-PCR和Western blot检测心肌组织UCP2表达情况;(2)进行心脏Masson染色观察心肌纤维化情况;(3)利用透射电镜观察心肌线粒体形态变化。3.小鼠心肌细胞系(MCMs)分为3组:高糖(25 mmol/L)组+0μmol/L软脂酸钠干预、高糖+200μmol/L软脂酸钠组、高糖+300μmol/L软脂酸钠组,并分别干预9小时和18小时。(1)q RT-PCR和Western blot检测gpr35的表达;(2)通过流式细胞术检测细胞的凋亡变化;(3)DHE及ROS ELISA试剂盒检测高糖+0μmol/L软脂酸钠干预组、高糖+300μmol/L软脂酸钠组ROS变化。而后,进一步将高糖+300μmol/L软脂酸钠组分为5组:Vehicle组,Zap组(Zaprinast组),CID组(CID-2745687组),Zap+NAC组(Zaprinast+NAC组),Gen组(Genipin组)。结果:1.与对照组相比,实验组小鼠体重、空腹血糖、血清胰岛素含量均明显升高,糖耐量和胰岛素耐量异常,并且血清TG、TC、FFA含量也较对照组小鼠明显升高。2.通过流式细胞术发现,心肌细胞凋亡比例随着软脂酸钠的浓度(0、200、300μmol/L)和干预时间(9、18小时)增加而增加。且选择300μmol/L软脂酸钠干预18小时作为最佳干预条件用于后续细胞实验。3.与对照组相比,糖尿病伴高脂血症导致小鼠血清BNP升高、心肌纤维化加重,E/A比值及LVEDD明显降低,线粒体形态破坏。4.通过q RT-PCR和Western blot发现,实验组gpr35表达水平及ROS水平明显增加;抑制gpr35能够降低ROS的生成及细胞凋亡;抗氧化剂(NAC)能够逆转gpr35上调所导致ROS生成增多及凋亡增加。5.与对照组相比,实验组UCP2的表达明显降低;下调gpr35可以增加UCP2的表达,反之,激动gpr35能够抑制UCP2的表达。此外,实验还发现,下调UCP2会加重糖脂代谢性心肌损伤,表现为心肌纤维化增加,线粒体形态破坏,膜电位及ATP生成减少,ROS及凋亡增加。结论:gpr35与UCP2的互相拮抗作用通过氧化应激通路调节糖脂代谢性心肌损伤。

关键词： T2DM 高脂血症 gpr35 UCP2 ROS

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gpr35缺失抑制主动脉夹层形成的机制研究

GPR35缺失抑制主动脉夹层形成的机制研究

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作者：宋志平川北医学院

学位级别：硕士

目的:明确G-protein-coupled receptor 35（gpr35）是否参与主动脉夹层（aortic dissection,AD）的形成,探究gpr35缺失是否通过抑制核因子NF-κB,从而减少主动脉的炎症反应和平滑肌凋亡发挥AD保护作用。方法:本研究通过给实验小鼠泵入了... 详细信息

目的:明确G-protein-coupled receptor 35（gpr35）是否参与主动脉夹层（aortic dissection,AD）的形成,探究gpr35缺失是否通过抑制核因子NF-κB,从而减少主动脉的炎症反应和平滑肌凋亡发挥AD保护作用。方法:本研究通过给实验小鼠泵入了 4.5mg/kg/d的血管紧张素（Angiotensin,Ang）-Ⅱ,建立小鼠AD模型;为确定主动脉组织中gpr35表达变化,我们使用了 q-PCR及Western-blot等检测方法;并通过HE染色、VVG染色评估主动脉管壁及弹性纤维损伤情况;为评估小鼠体内炎症因子含量,主动脉单核巨噬细胞浸润程度及主动脉内炎症因子表达,我们分别应用了 ELISA、免疫组化和q-PCR等检测手段;采用TUNEL染色及测定活化Caspase-3表达变化评定小鼠主动脉平滑肌凋亡情况;应用Western-blot明确小鼠主动脉组织中NF-κB P65及其磷酸化蛋白表达变化。结果:通过大体解剖及HE染色发现,Ang-Ⅱ能够诱导较为典型的AD形成;在AD中gpr35表达明显上调（P＜0.05）;Ang-Ⅱ干预后,53.3%的野生型小鼠出现AD,而gpr35敲除后,AD发生率明显降低（13.3%）,同时也降低了小鼠主动脉最大直径（P＜0.05）。病理结果示,在输注Ang-II后,野生型小鼠主动脉扩张明显,小鼠主动脉壁各层结构明显破坏,同时存在弹性纤维损伤,甚至断裂。部分小鼠可见动脉假腔形成。敲除gpr35后小鼠主动脉结构明显被改善;肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α,白细胞介素（Interleukin,IL）-6作为炎症介质的代表在AD小鼠血清中的含量明显增加,而gpr35敲除使炎症介质的分泌明显受抑,伴随单核巨噬细胞在主动脉组织内的入侵显著减少,以及IL-6、TNF-αmRNA的表达明显下调（P＜0.05）;TUNEL染色可见,AD中平滑肌细胞凋亡显著,gpr35缺失可抑制活化Caspase-3表达,减少平滑肌细胞凋亡（P＜0.05）;在AD中NF-κB P65蛋白及其磷酸化蛋白表达上调,敲除gpr35抑制了 NF-κBP65蛋白及其磷酸化蛋白表达（P＜0.05）。结论:gpr35参与AD的形成,同时gpr35缺失通过抑制NF-κB,减少炎症及主动脉平滑肌凋亡发挥AD保护作用。

关键词：主动脉夹层 gpr35 炎症凋亡 NF-κB

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gpr35基因调控PI3K/AKt/mTOR信号通路对乳腺癌细胞增殖的研究

GPR35基因调控PI3K/AKt/mTOR信号通路对乳腺癌细胞增殖的研究

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作者：李红娜桂林医学院

学位级别：硕士

目的:从分子学探讨G蛋白偶联受体35（G Protein-Coupled Receptor 35,gpr35）调控磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响,以及gpr35基因上调引起肿瘤坏死因子受体相关蛋白1蛋白表达变化对乳... 详细信息

目的:从分子学探讨G蛋白偶联受体35（G Protein-Coupled Receptor 35,gpr35）调控磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响,以及gpr35基因上调引起肿瘤坏死因子受体相关蛋白1蛋白表达变化对乳腺癌发病机制的研究。方法:首先培养乳腺癌细胞（MDA-MB-231）,采用基因修饰方法构建研究所用的过表达gpr35细胞模型,采用Western blot和免疫荧光检测乳腺癌细胞中gpr35的表达;采用MTT方法检测过表达gpr35后乳腺癌细胞增殖率的变化。采用qPCR方法检测过表达gpr35后乳腺癌细胞中PI3K、AKt1、AKt3、mTOR、TRAP1mRNA的表达水平;采用Western blot验证基因的表达,检测调控信号通路蛋白PI3K、总AKt、总mTOR的表达以及TRAP1蛋白的表达,进一步检测过表达gpr35后乳腺癌细胞中p-PI3K、p-AKt、p-mTOR蛋白的表达水平。结果:Western blot方法检测乳腺癌细胞中过表达gpr35a组和过表达gpr35b组中gpr35蛋白的表达水平均高于正常组（p＜0.05）,其中过表达gpr35b组gpr35蛋白的表达水平高于过表达gpr35a组（p＜0.05）;细胞免疫荧光染色实验方法确定gpr35主要定位于胞浆中,与正常组作对比,过表达gpr35a组和过表达gpr35b组乳腺癌细胞中gpr35蛋白（绿色）的表达明显增加;MTT方法检测乳腺癌细胞增殖实验表明,过表达gpr35a组和过表达gpr35b组乳腺癌细胞的增殖率明显高于正常组（p＜0.05）,其中过表达gpr35b组乳腺癌细胞的增殖率高于过表达gpr35a组（p＜0.05）;qPCR实验检测乳腺癌细胞中PI3K、AKt1、AKt3、mTOR基因的表达水平,正常组、过表达gpr35a组和过表达gpr35b组三组间两两比较均无明显变化（p＞0.05）;qPCR实验检测乳腺癌细胞中TRAP1 mRNA的表达水平,过表达gpr35a组和过表达gpr35b组TRAP1 mRNA的表达水平均高于正常组（p＜0.05）,其中过表达gpr35a组TRAP1 mRNA的表达水平高于过表达gpr35b组（p＜0.05）;Western blot方法检测乳腺癌细胞中PI3K、总AKt、总mTOR蛋白的表达水平,正常组、过表达gpr35a组和过表达gpr35b组三组间两两比较均无明显变化（p＞0.05）,与基因表达水平一致;而过表达gpr35a组和过表达gpr35b组p-PI3K、p-AKt、p-mTOR、TRAP1蛋白的表达水平均高于正常组（p＜0.05）,并且过表达gpr35b组p-PI3K、p-AKt、p-mTOR、TRAP1蛋白的表达水平均高于过表达gpr35a组（p＜0.05）。结论:（1）gpr35过表达能促进乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的增殖,与乳腺癌的发生、发展密切相关。（2）gpr35通过磷酸化激活PI3K/AKt/mTOR信号通路,上调TRAP1 mRNA和蛋白表达,促进乳腺癌细胞的增殖。

关键词： gpr35 PI3K/AKt/mTOR信号通路 TRAP1 乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖

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孤儿受体gpr35的结构生物学研究

孤儿受体GPR35的结构生物学研究

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作者：成心宇南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:gpr35是一种类视紫红质的A类G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),主要在胃、肠上皮细胞、树突状细胞以及小肠和结肠的巨噬细胞中表达。它在调节胃肠道稳态中扮演关键角色,并在代谢、免疫和肠道微生物系统之间... 详细信息

研究背景:gpr35是一种类视紫红质的A类G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),主要在胃、肠上皮细胞、树突状细胞以及小肠和结肠的巨噬细胞中表达。它在调节胃肠道稳态中扮演关键角色,并在代谢、免疫和肠道微生物系统之间提供了重要的联系。gpr35的信号转导失常与炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBDs)风险增加密切相关,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,以及原发性硬化性胆管炎。因此,gpr35的激活可能对于相关胃肠道疾病有重要的意义,gpr35作为胃肠道疾病的药物靶点,在炎症性肠病中有十分广阔的应用前景。然而,gpr35作为孤儿G蛋白偶联受体(Orphan G protein-coupled receptors,o GPCR),由于工具配体的缺乏,人们对gpr35的配体识别和信号传导机制的了解相对较少。同时,由于gpr35与其他A类GPCRs的序列同源性较低(低于20%),这也阻碍了对其结构的深入了解和工具配体的发现。因此,解析激活状态的gpr35结构能为进一步阐明gpr35在炎症性肠病中的功能提供线索,也能为靶向gpr35的小分子和多肽药物设计提供结构基础。目的:利用单颗粒冷冻电镜技术解析不同配体激活下的gpr35结合下游G蛋白的复合物蛋白结构,根据冷冻电镜结构阐明gpr35具体的配体结合模式和偏向性激活的信号转导机制,最后基于冷冻电镜结构为药物设计提供理论基础。方法:本研究利用Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统,异源共表达配体激活下gpr35结合下游G蛋白的复合物蛋白,通过克隆优化筛选,如融合标签筛选,添加融合蛋白,保守氨基酸位点突变,Nano Bi T方法,色氨酸突变和G蛋白GTP结合位点突变等确定最优克隆和纯化条件,然后进行大量表达纯化获得不同配体激活的gpr35结合不同G蛋白的复合物蛋白,通过分子型排阻色谱法,SDS-PAGE,Western Blot和120 k V负染电镜确定复合物蛋白性质后,再通过单颗冷冻电镜技术进行数据收集,最后利用cryo SPARC v3.3.2进行数据处理和结构解析。结果:本研究通过克隆优化筛选确定了将N端添加了融合蛋白BRIL,C端添加了Lg Bi T和10×His标签的野生型全长gpr35克隆至改造后的p Fast Bac1载体上,该载体的N端添加了HA信号肽和Flag标签。利用该克隆进行gpr35复合物的表达纯化,复合物的稳定性,均一性和产量是最佳的。保守位点的氨基酸突变和色氨酸突变并不能明显稳定复合物。通过克隆优化筛选确定了在Gα蛋白中引入五个GTP结合位点的氨基酸突变能有效稳定复合物。通过克隆优化筛选确定了工程嵌合体mini Gα能和gpr35形成稳定的复合物,野生型Gα不能进行有效的复合物组装。Nano Bi T方法能明显改善复合物的稳定性和均一性,功能试验结果说明Lg Bi T的引入可以提高gpr35的基础活性,并能有效帮助gpr35复合物的组装。确定复合物各组分的最优克隆后,进行复合物的大量表达纯化,成功纯化获得了Lodoxamide-gpr35-DNG、5-HIAA-gpr35-DNG和Lodoxamide-gpr35-mini G稳定且均一的高质量复合物蛋白。最后通过单颗粒冷冻电镜数据收集和结构解析,最终获得了3.39?的Lodoxamide-gpr35-DNG的冷冻电镜结构。结论:本研究成功表达纯化获得了Lodoxamide-gpr35-DNG、5-HIAA-gpr35-DNG和Lodoxamide-gpr35-mini G稳定均一的高质量复合物蛋白。最后通过单颗粒冷冻电镜数据收集和结构解析,最终获得了3.39?的Lodoxamide-gpr35-DNG的冷冻电镜结构。为了研究gpr35配体结合机制和gpr35与下游不同G蛋白相互作用机制提供了可能,也为基于结构的靶向gpr35药物研发提供了结构基础。

关键词： G蛋白偶联受体 gpr35 孤儿受体冷冻电镜炎症性肠病

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