孤儿受体GPR35的结构生物学研究

作     者：成心宇 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张进

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：G蛋白偶联受体 GPR35 孤儿受体 冷冻电镜 炎症性肠病 

摘      要：研究背景:GPR35是一种类视紫红质的A类G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),主要在胃、肠上皮细胞、树突状细胞以及小肠和结肠的巨噬细胞中表达。它在调节胃肠道稳态中扮演关键角色,并在代谢、免疫和肠道微生物系统之间提供了重要的联系。GPR35的信号转导失常与炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBDs)风险增加密切相关,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,以及原发性硬化性胆管炎。因此,GPR35的激活可能对于相关胃肠道疾病有重要的意义,GPR35作为胃肠道疾病的药物靶点,在炎症性肠病中有十分广阔的应用前景。然而,GPR35作为孤儿G蛋白偶联受体(Orphan G protein-coupled receptors,o GPCR),由于工具配体的缺乏,人们对GPR35的配体识别和信号传导机制的了解相对较少。同时,由于GPR35与其他A类GPCRs的序列同源性较低(低于20%),这也阻碍了对其结构的深入了解和工具配体的发现。因此,解析激活状态的GPR35结构能为进一步阐明GPR35在炎症性肠病中的功能提供线索,也能为靶向GPR35的小分子和多肽药物设计提供结构基础。目的:利用单颗粒冷冻电镜技术解析不同配体激活下的GPR35结合下游G蛋白的复合物蛋白结构,根据冷冻电镜结构阐明GPR35具体的配体结合模式和偏向性激活的信号转导机制,最后基于冷冻电镜结构为药物设计提供理论基础。方法:本研究利用Bac-to-Bac昆虫细胞表达系统,异源共表达配体激活下GPR35结合下游G蛋白的复合物蛋白,通过克隆优化筛选,如融合标签筛选,添加融合蛋白,保守氨基酸位点突变,Nano Bi T方法,色氨酸突变和G蛋白GTP结合位点突变等确定最优克隆和纯化条件,然后进行大量表达纯化获得不同配体激活的GPR35结合不同G蛋白的复合物蛋白,通过分子型排阻色谱法,SDS-PAGE,Western Blot和120 k V负染电镜确定复合物蛋白性质后,再通过单颗冷冻电镜技术进行数据收集,最后利用cryo SPARC v3.3.2进行数据处理和结构解析。结果:本研究通过克隆优化筛选确定了将N端添加了融合蛋白BRIL,C端添加了Lg Bi T和10×His标签的野生型全长GPR35克隆至改造后的p Fast Bac1载体上,该载体的N端添加了HA信号肽和Flag标签。利用该克隆进行GPR35复合物的表达纯化,复合物的稳定性,均一性和产量是最佳的。保守位点的氨基酸突变和色氨酸突变并不能明显稳定复合物。通过克隆优化筛选确定了在Gα蛋白中引入五个GTP结合位点的氨基酸突变能有效稳定复合物。通过克隆优化筛选确定了工程嵌合体mini Gα能和GPR35形成稳定的复合物,野生型Gα不能进行有效的复合物组装。Nano Bi T方法能明显改善复合物的稳定性和均一性,功能试验结果说明Lg Bi T的引入可以提高GPR35的基础活性,并能有效帮助GPR35复合物的组装。确定复合物各组分的最优克隆后,进行复合物的大量表达纯化,成功纯化获得了Lodoxamide-GPR35-DNG、5-HIAA-GPR35-DNG和Lodoxamide-GPR35-mini G稳定且均一的高质量复合物蛋白。最后通过单颗粒冷冻电镜数据收集和结构解析,最终获得了3.39?的Lodoxamide-GPR35-DNG的冷冻电镜结构。结论:本研究成功表达纯化获得了Lodoxamide-GPR35-DNG、5-HIAA-GPR35-DNG和Lodoxamide-GPR35-mini G稳定均一的高质量复合物蛋白。最后通过单颗粒冷冻电镜数据收集和结构解析,最终获得了3.39?的Lodoxamide-GPR35-DNG的冷冻电镜结构。为了研究GPR35配体结合机制和GPR35与下游不同G蛋白相互作用机制提供了可能,也为基于结构的靶向GPR35药物研发提供了结构基础。