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ggta1基因缺失五指山小型猪的制备

GGTA1基因缺失五指山小型猪的制备

作者：岳成鹤四川农业大学

学位级别：硕士

异种移植是解决人的移植用器官组织来源短缺问题的潜在解决途径之一,而猪被认为是异种器官组织的理想供体动物。以猪做供体向灵长类进行异种移植时存在一系列排斥反应,其中超急性排斥反应(HAR)是异种移植早期发生的首要免疫障碍。HAR是... 详细信息

异种移植是解决人的移植用器官组织来源短缺问题的潜在解决途径之一,而猪被认为是异种器官组织的理想供体动物。以猪做供体向灵长类进行异种移植时存在一系列排斥反应,其中超急性排斥反应(HAR)是异种移植早期发生的首要免疫障碍。HAR是由灵长类体内预存的针对αGa1表位的天然抗体介导产生的排斥反应。ggta;基因的失活能够减少多数αGa1表位的产生,从而基本阻断HAR。本研究在已成功制备的ggta1+/-五指山小型猪基础上,通过优化筛选方法获得了ggta1基因缺失细胞,并通过体细胞核移植技术成功生产了ggta1基因缺失五指山小型猪,结果如下：研究一：以ggta1+/-胎儿成纤维细胞为材料,采用同源重组、抗性筛选标记为puro的第二轮基因打靶与嘌呤霉素进行细胞筛选,共获得了36个抗性细胞克隆,经PCR鉴定无ggta1-/-细胞,表明该方法效率太低,不适于作为常规制备ggta1-/-细胞的方法;研究二：以源于ggta1+/-五指山小型猪再克隆胎儿的成纤维细胞系为材料,采用特异结合αGa1的药物GSI-B4和艰难梭菌毒素A(TcdA),结合免疫磁珠(MACS)和流式细胞术(FACS)筛选αGal表位缺失的细胞。通过GSI-B4联合免疫磁珠获得了11个单细胞克隆,其中2个是ggta1-/-细胞克隆;联合MACS与FACS获得了3个细胞集落,经PCR鉴定不是预期的ggta1-/-细胞克隆;TcdA联合FACS获得了4个细胞集落,经PCR鉴定,均为ggta1-/-细胞克隆。实验共获得18个单细胞克隆／细胞集落,经PCR鉴定有6个是ggta1-/-细胞克隆,效率为33.3%。研究三：以ggta1-/-细胞为核供体,去核的体外成熟猪卵母细胞为胞质供体,通过体细胞核移植构建重构胚胎,将一定数量的重构胚移入受体母猪;总共向12.5头受体母猪移植重构胚3122枚,其中4头受体母猪怀孕至妊娠期满,出生存活五指山小型猪仔猪12头,经PCR、Southern blotting进行ggta1基因型检测,鉴定出ggta1-/-猪11头;采集克隆仔猪耳组织建立成纤维细胞系,经流式细胞术对细胞表面抗原αGa1的检测表明,ggta1-/-猪的成纤维细胞表面几乎不表达αGa1,证实该11头五指山小型猪缺失ggta1基因。上述结果表明,用特异性药物TcdA毒素、MACS和FACS可以将-Ga1表位缺失ggta1基因缺失细胞筛选出来,而上述方法的适当联合可以获得较高的富集效率。单独采用基于同源重组的第二次基因打靶筛选ggta1基因缺失细胞的效率太低,难以敲除突变型ggta1基因的等位基因。本研究还首次证明了由流式细胞分选术制备的ggta1-/-五指山小型猪胎儿成纤维细胞可以用于ggta1基因缺失-五指山小型的制备。总之,本研究在国内首次成功制备ggta1基因缺失五指山小型猪,为制备进一步消除HAR的异种移植研究用猪奠定了坚实的基础。

关键词：异种移植 ggta1基因基因缺失五指山小型猪体细胞核移植

ggta1基因敲除巴马小型猪SLA单倍型分型及转hEPCR基因猪的制备

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GGTA1基因敲除巴马小型猪SLA单倍型分型及转hEPCR基因猪的制备

作者：高景波甘肃农业大学

学位级别：硕士

猪是人异种器官移植的理想供体,由α-1,3半乳糖苷(α-1,3Gal)引起的猪到人器官移植的超急性排斥反应已经基本解决,但是随之而来的细胞性排斥反应以及血栓和炎症成为目前亟待解决的问题,猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)是引... 详细信息

猪是人异种器官移植的理想供体,由α-1,3半乳糖苷(α-1,3Gal)引起的猪到人器官移植的超急性排斥反应已经基本解决,但是随之而来的细胞性排斥反应以及血栓和炎症成为目前亟待解决的问题,猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)是引起异种移植细胞性免疫排斥的主要因素之一,转人内皮蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor,EPCR)可以有效降低猪到人器官移植引起的血栓和炎症。本研究主要探讨了α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,ggta1)基因敲除巴马小型猪(Bama minipig,BMP)的健康水平以及SLA等位基因和单倍型为异种器官移植研究筛选细胞排斥低的供体,制备可以降低异种器官移植引起的炎症和血栓反应的转hEPCR基因猪。本论文共有三部分研究内容,分别为:***1基因敲除巴马小型猪的繁育及健康水平检测。本课题组制备的ggta1基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪已经繁育到F3代。本研究跟踪了GTKO巴马小型猪的遗传、窝产仔数和血常规血生化指标,评估其繁殖和健康状况。通过PCR产物测序鉴定仔猪ggta1基因敲除类型,FITC-GSIB4与仔猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)孵育后流式细胞术检测α-1,3-Gal表达,以窝产仔数测定繁殖力,以血常规和血生化检测反映健康状况。结果显示,ggta1基因的遗传符合孟德尔分离定律;ggta1敲除纯合子(ggta1-/-)仔猪的流式检测荧光强度低;GTKO巴马猪母猪头胎窝产仔数为7.38±1.64头,经产母猪窝产仔数为9.43±1.68头,与已有报道的普通巴马小型猪繁殖力无明显差异;血常规血生化检测的各项指标与普通巴马猪基本无差异。总之,连续3代GTKO巴马仔猪遗传稳定,繁殖力正常,生理健康。GTKO巴马小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。***1基因敲除巴马小型猪SLA单倍型分型。本研究主要对SLA基因上5个位点(SLA-1、SLA-2、SLA-3、SLA-DRB1和SLA-DQB1)进行研究。采用转录本PCR产物直接测序的方法获得GTKO巴马小型猪SLA等位基因和单倍型,补体依赖的淋巴细胞毒试验(Complementdependent cytotoxicity,CDC)检测不同SLA单倍型猪的PBMC与人血清反应的细胞死亡率。结果发现,ggta1基因敲除巴马小型猪群的5个SLA位点共发现15个等位基因,其中SLA-2*05:07(序列号:KX022946)和SLA-3*03:10(序列号:KX022947)2条序列为新发现序列,ggta1基因敲除巴马小型猪群共有5个SLA单倍型,分别为Hp-80.27、Hp-81.27、Hp-83a.45、Hp-82.44和Hp-83b.10c。4种杂合单倍型(Hp-80.27/81.27,Hp-82.44/83b.10c,Hp-80.27/83b.10c和Hp-83a.45/83b.10c)猪CDC结果细胞死亡率都小于27.5%,Hp-80.27/81.27和Hp-82.44/83b.10c单倍型的猪CDC结果细胞死亡率都小于17%。结果表明,不同SLA单倍型猪PBMC与人血清CDC试验结果不同,Hp-80.27/81.27和Hp-82.44/83b.10c单倍型的猪CDC结果细胞死亡率更低,更适合做异种器官移植研究供体。3.转hEPCR基因猪的制备。本研究构建广泛性表达启动子CAG调控的hEPCR基因表达载体pCAGGS-hEPCR-Puro,转染巴马五指山杂交猪胎儿成纤维细胞,通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪。利用PCR技术对克隆仔猪进行转基因鉴定,同时通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot及免疫组化方法分析hEPCR在转基因猪的各个器官中的表达。本研究成功构建了pCAGGS-hEPCR-Puro载体,转染细胞后筛选出71个有效克隆点,共得到2头转hEPCR阳性仔猪,qRT-PCR检测发现hEPCR基因在克隆仔猪肝脏、肾脏、心脏、脾脏、胰脏、肺脏、主动脉等主要器官都有表达,在主动脉、胰脏、肺脏中的表达水平较高。Western Blot和免疫组化结果表明hEPCR蛋白在耳朵、主动脉,胰脏、心脏和肾脏都有表达。本研究成功制备了转hEPCR基因猪,并且hEPCR基因在克隆猪的主要器官组织都有较高的表达水平,为异种器官移植研究制备了良好供体。

关键词： ggta1基因小型猪白细胞抗原内皮蛋白C受体异种移植

利用同源重组载体和体细胞克隆技术生产MSTN基因和ggta1基因敲除猪

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利用同源重组载体和体细胞克隆技术生产MSTN基因和GGTA1基因敲除猪

作者：朱彦宾甘肃农业大学

学位级别：硕士

为了探索基因敲除猪的生产方法,本研究采用同源重组技术和体细胞核移植技术相结合的方法,生产肌肉生长抑制素(MSTN)基因敲除猪和α1,3半乳糖基转移酶(ggta1)基因敲除猪,为猪转基因育种和人类异种器官移植研究提供基础资料。结果如下: 1... 详细信息

为了探索基因敲除猪的生产方法,本研究采用同源重组技术和体细胞核移植技术相结合的方法,生产肌肉生长抑制素(MSTN)基因敲除猪和α1,3半乳糖基转移酶(ggta1)基因敲除猪,为猪转基因育种和人类异种器官移植研究提供基础资料。结果如下: 1.生产MSTN基因敲除猪。采用正负筛选打靶载体pLOXP -MSTN -KO通过同源重组敲除大白猪胎儿成纤维细胞MSTN基因的第3外显子。以打靶阳性细胞克隆为供体细胞进行核移植,克隆胚胎经融合激活后进行体外培养。1-细胞期和2-4细胞期MSTN克隆胚胎分别移植10头和5头受体母猪,35d B-超妊娠检测移植1-细胞期克隆胚胎的受体母猪有7头妊娠,妊娠率为70%,移植2-4细胞期克隆胚胎有2头妊娠,妊娠率为40%。妊娠足月后分别产仔27头和4头,Southern杂交鉴定均为MSTN单等位基因敲除猪,基因敲除体细胞的克隆效率分别为1.0%和0.4%。胚胎移植结果表明,1-细胞期克隆胚胎有利于受体母猪妊娠,同时可提高克隆效率。季节影响基因敲除克隆仔猪的出生成活率。春季移植夏季出生克隆仔猪16头,8月龄时存活12头,成活率为75%。夏季移植秋季出生克隆仔猪15头,8月龄时存活5头,成活率为33%,表明夏季有利于克隆仔猪的出生成活。基因敲除猪的MSTN基因表达和表型初步研究结果表明,MSTN基因的表达量与普通阴性猪相比下降90%。从外部表型观察,MSTN猪臀部肌肉发育较普通猪明显发达,其他性状正在观测中。 2.生产ggta1基因敲除猪。采用启动子缺陷型打靶载体pBS-ggta1-SKO同源重组敲除近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞ggta1基因,以获得的阳性克隆为供体细胞进行体细胞核移植,ggta1克隆胚胎培养到1-4细胞期移植7头自然发情的受体母猪,35d B-超妊娠检测有5头受体母猪妊娠,妊娠率为71%,妊娠足月产仔20头。Southern杂交鉴定全部为ggta1单等位基因敲除猪,基因敲除体细胞克隆效率为1.3%,单窝产活仔数最高达10头。季节影响基因敲除克隆仔猪的出生存活。夏季移植秋季出生的克隆活仔猪4头,6月龄时存活3头,成活率为75%,秋季移植冬季出生的克隆仔猪15头,6月龄时存活6头,成活率为33%,表明夏季移植比冬季有利于克隆仔猪出生成活。 3.提高近交系猪的克隆效率,试验采用Scriptaid(一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)处理近交系克隆胚胎。重构胚胎激活后,在添加不同浓度的Scriptaid (0～300 nmol/L)胚胎培养液中培养,在不同的时间(0～36h)观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,以评价克隆胚胎的体外发育能力。结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h克隆胚胎的囊胚发育率显著提高(30.4%vs. 17.5%, P<0.05)。将100 nmol/L Scriptaid处理24h的克隆胚胎和对照组胚胎分别移植4头受体母猪,发现处理组克隆胚胎的平均窝产仔数和克隆效率均高于对照组(5 vs.1.5;2.4% vs.0.7%;P<0.05)。可见,培养液中添加100 nmol/L的Scriptaid、且处理24h,有利于提高近交系五指山小型猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率。

关键词：大白猪近交系五指山小型猪体细胞核移植基因敲除 MSTN基因 ggta1基因

利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪ggta1基因

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利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因

作者：郑道山南方医科大学

学位级别：硕士

1954年,第一例人类同种肾移植手术在美国完成,开启了人类医学的新时代,这项研究的开创者约瑟夫·默里也获得了1990年诺贝尔医学与生理学奖。随着现代医学的不断进步,器官移植的存活率大幅提高,接受手术的人数也大幅增长。人类同种异体... 详细信息

1954年,第一例人类同种肾移植手术在美国完成,开启了人类医学的新时代,这项研究的开创者约瑟夫·默里也获得了1990年诺贝尔医学与生理学奖。随着现代医学的不断进步,器官移植的存活率大幅提高,接受手术的人数也大幅增长。人类同种异体器官移植已经拯救了成千上万器官衰竭患者的生命,被誉为"21世纪医学之巅”。然而,随着器官移植需求数量的增长,器官短缺的问题也日益凸显,已经成为制约临床器官移植发展的主要瓶颈。异种移植可以缓解器官不足的现状,猪由于在解剖学、生理学等方面与人类的相似性,成为科学界公认的异种器官移植最合适的异种器官来源。然而,猪器官应用于临床实验面临着诸多难题,其中最为关键的障碍是超急性排斥反应(Hyperacute Rejection,HAR)。HAR主要是由a1,3-半乳糖基转移酶(al,3-galactosyltransferase, ggta1)基因编码的形成的aGal表位引起,通过敲除ggta1基因可以消除aGal表位从而克服HAR,自从2003年以来,国外已有报道缺失ggta1基因的猪器官已经用于异种器官移植实验并成功克服了HAR。然而,国内这方面的研究起步较晚,尚未见有ggta1基因敲除克隆猪出生的报道。五指山近交系小型猪是我国培育的高度近交群体。其基因高度纯合,便于基因工程操作;血液生理生化指标与人类接近,器官大小近似人类,是更为理想的异种器官移植供体。本研究构建了以新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,neo)为筛选标记基因的启动子缺陷型打靶载体,neo基因上游加入Kozak序列以增加翻译效率。打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选。用PCR法检测药物抗性的细胞克隆点。转染筛选共得到499个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组。以其中1个ggta1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,一头受体怀孕,分娩获得2头克隆猪,分别编号为WZSP-KO01和WZSP-KO02,经过PCR和Southern鉴定均为ggta1单等位基因敲除克隆猪。本研究培育ggta1基因敲除的五指山小型猪,为异种器官移植研究提供基础平台。研究内容主要分为以下三个部分：第一部分：启动子缺陷型打靶载体pBS-ggtal-SKO的构建根据NCBI数据库的ggta1基因序列设计引物,LAF/LAR和SAF/SAR分别扩增5684bp的同源长臂,1692bp的同源短臂。以近交系五指山小型猪基因组为模版,PCR扩增得到5684bp的同源长臂(Long Arm,LA),1692bp的同源短臂(Short Arm,SA),将LA和SA分别克隆到T载体pEASY-T1 Simple上,测序正确后得到重组载体pEASY-T1-LA, pEASY-T1-SA。打靶骨架载体pBluescriptⅡSK(+)和pEASY-T1-SA分别用KpnⅠ和BglⅡ双酶切、凝胶电泳回收载体骨架PBS和SA片段,用T4 DNA连接酶连接,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后得到载体PBS-SA。载体PBS-SA和pIRESneo分别用SmaⅠ和XhoⅠ双酶切、凝胶电泳回收PBS-SA和neo片段,用T4DNA连接酶连接,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后得到载体PBS-SA-neo。载体PBSSA-neo和pEASY-T1-LA分别用NotⅠ和ClaⅠ双酶切、凝胶电泳回收PBS-SA-neo和LA片段,用T4 DNA连接酶连接,转化后筛选重组子、提取质粒后经酶切鉴定后获得五指山小型猪ggta1基因敲除载体pBS-ggta1-SKO。打靶载体pBS-ggta1-SKO全长约12Kb,包括5684bp同源长臂LA和1692bp同源短臂SA, pBS-ggta1-SKO质粒经不同的限制性内切酶酶切后获得相应的正确的大小不等的片段。第二部分：五指山小型猪胎儿成纤维细胞的转染筛选与鉴定利用限制性内切酶ClaⅠ酶切质粒pBS-ggta1-SKO,使之线性化。细胞采用Amaxa NucleofectorⅡ核转染仪及配套转染试剂进行转染。转染前将细胞接种至六孔板中,待细胞长至80-90%汇合时,利用电转染法将线性化的打靶载体pBS-ggta1-SKO按照NucleofectorⅡ核转染仪程序T016转染至五指山猪胎儿成纤维细胞,24h后加入G418(250μg/mL)筛选10-15 d,然后将具有抗性的细胞克隆传至24孔板中进行扩增,每孔细胞按1：2传至另一24孔板中,取其中1孔细胞用于PCR鉴定,另1孔细胞冻存备用。提取抗性细胞克隆点DNA进行PCR鉴定,对阳性细胞克隆同

关键词：五指山小型猪基因敲除 ggta1基因超急性排斥反应

利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪ggta1基因

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生物技术通讯 2011年第4期22卷 458-462页

作者：郑道山冯冲朱彦宾龙川冯书堂潘登科马文丽南方医科大学基因工程研究所广东广州510515 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州730070

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(ggta1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中... 详细信息

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(ggta1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个ggta1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为ggta1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪ggta1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了ggta1单等位基因敲除的胎儿,为培育ggta1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。

关键词：五指山小型猪基因敲除 ggta1基因胎儿成纤维细胞

CRISPR-Cas9敲减猪ggta1基因的质粒构建

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深圳中西医结合杂志 2015年第18期25卷 1-3,F0003页

作者：牟丽莎温春圣谢崇伟蔡志明深圳市第二人民医院深圳大学第一附属医院深圳市驯化器官医学工程技术研究开发中心广东深圳518035

目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪ggta1基因的敲减质粒。方法:将Lenti CRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪ggta1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,对Lenti CRISPR-v2质粒进行Bsm BI酶切... 详细信息

目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪ggta1基因的敲减质粒。方法:将Lenti CRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪ggta1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,对Lenti CRISPR-v2质粒进行Bsm BI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与g RNA序列进行连接,构建Lenti CRISPR-v2-g RNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的Lenti CRISPR-v2-g RNA敲减质粒进行Kpn I与Eco RI双酶切验证与序列测定。结果:Lenti CRISPR-v2载体酶切结果正确;目的 g RNA序列成功插入酶切后的Lenti CRISPR-v2载体且序列正确。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪ggta1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪ggta1基因的效率与功能研究奠定了基础。

关键词：基因敲减 CRISPR-Cas9 ggta1基因

基因组编辑技术介导的猪ggta1/ASGR1基因敲除研究

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基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

作者：李西睿河南大学

学位级别：硕士

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-... 详细信息

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-人异种肝脏移植面临诸多障碍,其中超急性免疫排斥反应和血小板减少症是两个首要攻克难题。猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,ggta1)催化形成的αGal表位抗原,与人体天然存在的αGal表位抗体结合会引发超急性免疫排斥反应。表达于猪肝窦内皮细胞和Kuffer细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因。本研究利用基因组编辑技术转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)分别介导猪ggta1和ASGR1基因的敲除,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了ggta1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,在避免超急性排斥反应的同时减缓血小板减少症,以期为异种肝移植的研究提供更好的材料。本学术论文有两项研究内容,研究结果如下:1、利用TALEN技术高效制备ggta1基因敲除五指山小型猪。针对猪ggta1基因第4外显子设计并构建两对TALENs打靶载体,将TALEN mRNA电转染猪耳成纤维细胞,经传代培养后采用免疫磁珠法高效富集获得47个单细胞克隆,PCR测序鉴定均为ggta1基因突变细胞,基因编辑效率高达100%。选择6种不同突变类型的ggta1双等位基因敲除细胞为核供体进行体细胞核移植,共移植6头受体母猪,6头均妊娠至终期共产克隆仔猪23头,采集仔猪耳组织样提取基因组DNA进行PCR测序鉴定,证实全部为ggta1基因敲除仔猪。对TALEN的17个潜在脱靶位点设计引物,PCR目的片段后测序,未发现脱靶现象。流式细胞术分析结果显示,仔猪α-Gal表位成功去除。血清裂解结果显示,ggta1基因敲除猪细胞能够有效抵抗正常人血清的排斥反应,表明有效克服了超急性免疫排斥。上述结果表明,TALEN技术结合免疫磁珠方法可高效敲除ggta1基因,通过体细胞核移植技术快速获得ggta1双等位基因敲除仔猪,成功克服了超急性免疫排斥。2、本研究在ggta1敲除的五指山小型猪基础上,利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,为异种肝移植后血小板减少症的研究提供良好的动物模型。针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)质粒共同电转染ggta1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞术富集表达绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,共挑取细胞克隆41个,经PCR产物测序,其中37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%;双等位基因敲除的细胞克隆30个,双等位基因敲除效率为73%。选择四个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植至4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,经PCR产物测序,所有6头仔猪均为ASGR1基因敲除猪;Western Blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,未检测到脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9快速高效地制备了ggta1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症。综上所述,本研究利用基因组编辑技术在猪体细胞实现了精确的基因编辑,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了ggta1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,克服了异种肝移植后发生的超急性免疫排斥,有望解决术后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。

关键词：异种肝移植基因组编辑技术 ggta1基因 ASGR1基因基因敲除猪

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α-半乳糖基抗原缺失模型兔的研制与评价

中国组织工程研究 2021年第2期25卷 281-285页

作者：穆钰峰魏利娜吴勇邵安良陈亮屈树新徐丽明中国食品药品检定研究院北京市102629 西南交通大学材料科学与工程学院四川省成都市611756

背景:有研究表明一种称为α-Gal的糖抗原是动物源性生物材料或异种器官移植引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原。目的:研制Gal抗原缺失兔模型,预期用于评价植入性医疗器械,其局部植入后对宿主的局部免疫反应及非特异性炎症反应风险。方... 详细信息

背景:有研究表明一种称为α-Gal的糖抗原是动物源性生物材料或异种器官移植引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原。目的:研制Gal抗原缺失兔模型,预期用于评价植入性医疗器械,其局部植入后对宿主的局部免疫反应及非特异性炎症反应风险。方法:选用SPF级6-8月龄新西兰大白兔作为模式动物蓝本,制备Gal抗原缺失兔模型。采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,针对调控兔子Gal抗原表达的ggta1基因第8外显子设计构建2条相辅的sgRNA。经转录后将ggta1 sgRNA mRNAs与Cas9 mRNA共显微注射到体外培养的兔子受精卵中,继续短暂体外培养后植入代孕母兔体内,经自然妊娠获得仔兔。基因编辑成功与否通过凝胶电泳和基因测序进行验证。Gal抗原的表达参照行业标准给出的方法(YY/T 1561-2017)进行检测。研究经中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所动物伦理委员会批准[批准号:中检动(福)第2017(B)007号]。结果与结论:①基因编辑后的胚胎被转移至4只代孕兔体内,自然妊娠后获得15只基因编辑仔兔,仔兔的外观发育及进食行为等未见异常;②凝胶电泳及基因测序结果显示15只仔兔中有14只的靶向基因被成功编辑,但编辑的碱基并不相同;随机检测其主要脏器Gal抗原,表达均降低了99.96%以上;③结果表明,Gal抗原缺失兔子有望用于动物源性医疗器械的免疫原性风险评价和异种骨、角膜等原位植入实验,以便能够更客观科学地评价动物源性医疗器械的安全性和有效性。

关键词： Gal抗原 ggta1基因 CRISPR/Cas9 基因编辑免疫原性模式动物原位植入 Gal抗原缺失兔子

应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第1期42卷 1-7页

作者：岳成鹤曹随忠李西睿冯冲龙川余树民储明星潘登科四川农业大学动物医学院四川雅安625014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,ggta1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-ggta1-SKO和pBS-ggta1-DKO电转染ggta1单等位基因敲除(ggta1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活... 详细信息

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,ggta1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-ggta1-SKO和pBS-ggta1-DKO电转染ggta1单等位基因敲除(ggta1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是ggta1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无ggta1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为ggta1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出ggta1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。

关键词：五指山小型猪基因缺失 ggta1基因成纤维细胞