CRISPR-Cas9敲减猪GGTA1基因的质粒构建

作     者：牟丽莎 温春圣 谢崇伟 蔡志明 MOU Li-sha;WEN Chun-sheng;XIE Chong-wei;CAI Zhi-ming

作者机构：深圳市第二人民医院 深圳大学第一附属医院深圳市驯化器官医学工程技术研究开发中心广东深圳518035 

出 版 物：《深圳中西医结合杂志》 (Shenzhen Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine)

年 卷 期：2015年第25卷第18期

页      面：1-3,F0003页

学科分类：0710[理学-生物学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81200465) 深圳市"三名"工程(驯化器官)项目(2015) 

主　　题：基因敲减 CRISPR-Cas9 GGTA1基因 

摘      要：目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒。方法:将Lenti CRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪GGTA1基因的g RNA(guide RNA,g RNA)序列,对Lenti CRISPR-v2质粒进行Bsm BI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与g RNA序列进行连接,构建Lenti CRISPR-v2-g RNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的Lenti CRISPR-v2-g RNA敲减质粒进行Kpn I与Eco RI双酶切验证与序列测定。结果:Lenti CRISPR-v2载体酶切结果正确;目的 g RNA序列成功插入酶切后的Lenti CRISPR-v2载体且序列正确。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪GGTA1基因的效率与功能研究奠定了基础。