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Generation of double knockout cattle via crispr-cas9 ribonucleoprotein(RNP)electroporation

Journal of Animal Science and Biotechnology 2024年第1期15卷 456-462页

作者： Gyeong-Min Gim Kyeong-Hyeon Eom Dong-Hyeok Kwon Dae-Jin Jung Dae-Hyun Kim Jun-Koo Yi Jae-Jung Ha Ji-Hyun Lee Seong-Beom Lee Woo-Jae Son Soo-Young Yum Won-Wu Lee Goo Jang Laboratory of Theriogenology and Biotechnology Department of Veterinary Clinical ScienceCollege of Veterinary Medicine and the Research Institute of Veterinary ScienceSeoul National UniversitySeoulRepublic of Korea LARTBio Co. Ltd.SeoulRepublic of Korea Gyeongsangbukdo Livestock Research Institute YeongjuRepublic of Korea Comparative Medicine Disease Research Center Seoul National UniversitySeoulRepublic of Korea

Background Genome editing has been considered as powerful tool in agricultural fields.However,genome editing progress in cattle has not been fast as in other mammal species,for some disadvantages including long gestational periods,single pregnancy,and high raising cost.Furthermore,technically demanding methods such as microinjection and somatic cell nuclear transfer(SCNT)are needed for gene editing in cattle.In this point of view,electroporation in embryos has been risen as an alternative.Results First,editing efficiency of our electroporation methods were tested for embryos.Presence of mutation on embryo was confirmed by T7E1 assay.With first combination,mutation rates for MSTN and PRNP were 57.6%±13.7%and 54.6%±13.5%,respectively.In case of MSTN/BLG,mutation rates were 83.9%±23.6%for MSTN,84.5%±18.0%for BLG.Afterwards,the double-KO embryos were transferred to surrogates and mutation rate was identified in resultant calves by targeted deep sequencing.Thirteen recipients were transferred for MSTN/PRNP,4 calves were delivered,and one calf underwent an induction for double KO.Ten surrogates were given double-KO embryos for MSTN/BLG,and four of the six calves that were born had mutations in both genes.Conclusions These data demonstrated that production of genome edited cattle via electroporation of RNP could be effectively applied.Finally,MSTN and PRNP from beef cattle and MSTN and BLG from dairy cattle have been born and they will be valuable resources for future precision breeding.

关键词： Beta-lactoglobulin Cattle crispr-cas9 Electroporation Knockout MSTN PRNP

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Genome editing of PAR2 through targeted delivery of crispr-cas9 system for alleviating acute lung inflammation via ERK/NLRP3/IL-1β and NO/iNOS signalling

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2024年第3期14卷 1441-1456页

作者： Xin Zhuo Yue Wu Xiujuan Fu Jianbin Li Yuxin Xiang Xiaoyu Liang Canquan Mao Yuhong Jiang Sichuan Engineering Research Center for Biomimetic Synthesis of Natural Drugs School of Life Science and EngineeringSouthwest Jiaotong UniversityChengdu 610031China

Excessive and uncontrollable inflammatory responses in alveoli can dramatically exacerbate pulmonary disease progressions through vigorous cytokine releases,immune cell infiltration and protease-driven tissue damages.It is an urgent need to explore potential drug strategies for mitigating lung inflammation.Protease-activated receptor 2(PAR2)as a vital molecular target principally participates in various inflammatory diseases via intracellular signal transduction.However,it has been rarely reported about the role of PAR2 in lung inflammation.This study applied crispr-cas9 system encoding cas9 and sg RNA(p cas9-PAR2)for PAR2 knockout and fabricated an anionic human serum albuminbased nanoparticles to deliver p cas9-PAR2 with superior inflammation-targeting efficiency and stability(TAP/p cas9-PAR2).TAP/p cas9-PAR2 robustly facilitated p cas9-PAR2 to enter and transfect inflammatory cells,eliciting precise gene editing of PAR2 in vitro and in vivo.Importantly,PAR2 deficiency by TAP/p cas9-PAR2 effectively and safely promoted macrophage polarization,suppressed proinflammatory cytokine releases and alleviated acute lung inflammation,uncovering a novel value of PAR2.It also revealed that PAR2-mediated pulmonary inflammation prevented by TAP/p cas9-PAR2was mainly dependent on ERK-mediated NLRP3/IL-1β and NO/i NOS signalling.Therefore,this work indicated PAR2 as a novel target for lung inflammation and provided a potential nanodrug strategy for PAR2 deficiency in treating inflammatory diseases.

关键词： Protease-activated receptor 2(PAR2) crispr-cas9 Gene editing Inflammation Acute lung inflammation NLRP3 Nanoparticles Drug delivery

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利用crispr-cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

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中国实验血液学杂志 2024年第1期32卷 52-56页

作者：满建呈成娟赵丽兰州大学第一临床医学院兰州大学第一医院中心实验室甘肃省血液病遗传研究重点实验室甘肃兰州730000

目的:通过crispr-cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系... 详细信息

目的:通过crispr-cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用crispr-cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(Pcrispr-cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

关键词：急性髓系白血病 HOXA5基因 crispr-cas9

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比较crispr/cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响

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中国畜牧杂志 2024年第5期60卷 293-298,338页

作者：邱梅玉张雪梅张宁徐鑫刘明军新疆畜牧科学院生物技术研究所农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室新疆动物生物技术重点实验室新疆乌鲁木齐830000

为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因crispr/cas9和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定crispr/cas9和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LenticrisprV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个(34.73%),eGFP-crispr/cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个(36.32%)。本试验成功构建LenticrisprV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,crispr/cas9编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。

关键词： crispr-cas9 引导编辑(PE) eGFP基因 FITC-A-Mean Hi-TOM深度测序

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crispr-cas9基因编辑技术及其在家禽中的研究进展

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生物技术通报 2024年第5期40卷 38-47页

作者：肖怡梦杨雯程依依罗刚江苏科技大学生物技术学院江苏省蚕桑与畜禽生物技术重点实验室镇江212100

crispr-cas系统是细菌或古细菌内抵御病毒再次入侵的一种适应性免疫系统,能够对靶向核酸进行切割。基于cas9蛋白及其突变体的特性,科学家开发出多样化的基因编辑工具,能够对细胞内的基因进行敲除或敲入等基因编辑操作,实现生物的遗传变... 详细信息

crispr-cas系统是细菌或古细菌内抵御病毒再次入侵的一种适应性免疫系统,能够对靶向核酸进行切割。基于cas9蛋白及其突变体的特性,科学家开发出多样化的基因编辑工具,能够对细胞内的基因进行敲除或敲入等基因编辑操作,实现生物的遗传变异;或对DNA或RNA进行表观修饰,调控基因的表达,已广泛地应用于生命科学的研究。禽类是农业中的重要物种,为人类提供优质的蛋白质。在禽类的基因组编辑和修饰中,crispr-cas9技术仍处于研究状态,且只在鸡和鹌鹑两种家禽上取得实质性进展。本文从crispr-cas9系统的组成成分、传递方法、优化策略介绍了crispr-cas9基因编辑技术及其在家禽生产和疾病防控中的应用,为进一步开发适用于家禽体系的crispr-cas9提供理论基础。

关键词：家禽 crispr-cas9 育种诊断

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基于crispr-cas9系统构建LEU1基因缺失酿酒酵母用于酿造低醉酒度米酒

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中国酿造 2024年第4期43卷 62-67页

作者：王泽翔何娇娇梁思宇周世水华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 广东石湾酒厂集团有限公司广东佛山528031

为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋... 详细信息

为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(crispr-cas9)系统构建LEU1基因缺失的酿酒酵母XF0-L。将出发菌株XF0和重组菌株XF0-L进行培养基模拟发酵和米酒发酵,测定发酵酒的理化指标和高级醇含量。结果表明,菌株XF0-L与XF0模拟发酵酒的理化指标无显著差异(P>0.05),说明LEU1基因的缺失对酿酒酵母发酵性能无影响。相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L模拟发酵酒中正丙醇(26.27 mg/L)和异丁醇含量(88.64 mg/L)分别提高21.96%和85.25%,异戊醇含量(141.82 mg/L)、异戊醇/正丙醇(5.39)、异戊醇/异丁醇(1.60)分别降低15.53%、30.99%、54.42%;相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L发酵米酒中正丙醇(268.67 mg/L)和异丁醇含量(992.33 mg/L)分别提高14.17%、52.90%,异戊醇含量(1016.33 mg/L)、异戊醇/正丙醇(3.78)、异戊醇/异丁醇(1.02)分别降低13.58%、24.40%、43.65%,说明重组菌株XF0-L能够显著降低发酵酒中的异戊醇/正丙醇、异戊醇/异丁醇从而降低醉酒度(P<0.05)。

关键词：酿酒酵母 crispr-cas9 LEU1基因高级醇低醉酒度米酒

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crispr-cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的应用和不足

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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2024年第1期 120-125页

作者：王旭航陈振兵华中科技大学同济医学院附属协和医院湖北武汉430000

RNA引导的crispr-cas9核酸酶系统最初作为适应性免疫系统的一部分在细菌和古细菌中被发现。crispr-cas9在癌症免疫治疗、操纵癌基因组和表观基因组、消除或灭活致癌病毒等方面显示出巨大的癌症治疗前景。尽管其具有明显的优势和巨大的潜... 详细信息

RNA引导的crispr-cas9核酸酶系统最初作为适应性免疫系统的一部分在细菌和古细菌中被发现。crispr-cas9在癌症免疫治疗、操纵癌基因组和表观基因组、消除或灭活致癌病毒等方面显示出巨大的癌症治疗前景。尽管其具有明显的优势和巨大的潜力,未来要实现临床应用,仍然有诸多挑战待解决,如:编辑细胞的适合性、编辑效率、递送方法和潜在的脱靶效应等。本文将介绍crispr - cas9在肿瘤治疗中的潜在应用,并讨论crispr - cas9在临床治疗中中可能遇到的挑战。

关键词： crispr-cas9 肿瘤治疗应用基因

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Modernising autism spectrum disorder model engineering and treatment via crispr-cas9:A gene reprogramming approach

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World Journal of Clinical cases 2023年第14期11卷 3114-3127页

作者： Arushi Sandhu Anil Kumar Kajal Rawat Vipasha Gautam Antika Sharma Lekha Saha Department of Pharmacology Post Graduate Institute of Medical Education and Research(PGIMER)Chandigarh 0172ChandigarhIndia

A neurological abnormality called autism spectrum disorder(ASD)affects how a person perceives and interacts with others,leading to social interaction and communication issues.Limited and recurring behavioural patterns are another feature of the illness.Multiple mutations throughout development are the source of the neurodevelopmental disorder autism.However,a well-established model and perfect treatment for this spectrum disease has not been discovered.The rising era of the clustered regularly interspaced palindromic repeats(crispr)-associated protein 9(cas9)system can streamline the complexity underlying the pathogenesis of ASD.The crispr-cas9 system is a powerful genetic engineering tool used to edit the genome at the targeted site in a precise manner.The major hurdle in studying ASD is the lack of appropriate animal models presenting the complex symptoms of ASD.Therefore,crispr-cas9 is being used worldwide to mimic the ASD-like pathology in various systems like in vitro cell lines,in vitro 3D organoid models and in vivo animal models.Apart from being used in establishing ASD models,crispr-cas9 can also be used to treat the complexities of ASD.The aim of this review was to summarize and critically analyse the crisprcas9-mediated discoveries in the field of ASD.

关键词： Autism spectrum disorder crispr-cas9 Cellular models Organoids Animal models Therapeutic strategies

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Correction to“Genome-wide crispr-cas9 screening identifies that hypoxia-inducible factor-1a-induced CBX8 transcription promotes pancreatic cancer progression via IRS1/AKT axis”

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World Journal of Gastrointestinal Oncology 2022年第10期14卷 2085-2087页

作者： Bu-Wei Teng Kun-Dong Zhang Yu-Han Yang Zeng-Ya Guo Wei-Wei Chen Zheng-Jun Qiu Department of General Surgery Shanghai General Hospital of Nanjing Medical UniversityShanghai 200080China Department of General Surgery Lianyungang Clinical College of Nanjing Medical University/The First People’s Hospital of LianyungangLianyungang 222061Jiangsu ProvinceChina Department of General Surgery Shanghai General HospitalShanghai 200080China

Correction to“Genome-wide crispr-cas9 screening identifies that hypoxiainducible factor-1a-induced CBX8 transcription promotes pancreatic cancer progression via IRS1/AKT axis”(PMID:34853645 PMCID:PMC8603463 DOI:10.4251/wjgo.v13.i11.1709).In this article,the picture of Figure 6C was misused due to our carelessness while typesetting.We corrected this mistake,and replaced the incorrect image with the correct one.

关键词： Correction Error Figure crispr-cas9

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crispr-cas9 mediated phage therapy as an alternative to antibiotics

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Animal Diseases 2023年第4期3卷 231-241页

作者： Fikre Birhanu Balcha Sultan Abda Neja Faculty of Veterinary Medicine Hawassa UniversityPO.Box 05HawassaEthiopia Institute of Bioscience and Technology Texas A&M University2121 West Holcombe BlvdHoustonTX77030USA

Inappropriate use of antibiotics is globally creating public health hazards associated with antibiotic resistance.Bacteria often acquire antibiotic resistance by altering their genes through mutation or acquisition of plasmid-encoding resistance genes.To treat drug-resistant strains of bacteria,the recently developed crispr-cas9 system might be an alternative molecular tool to conventional antibiotics.It disables antibiotic-resistance genes(plasmids)or deactivates bacterial virulence factors and sensitizes drug-resistant bacteria through site-specific cleavage of crucial domains of their genome.This molecular tool uses phages as vehicles for crispr-cas9 delivery into bacteria.Since phages are species-specific and natural predators of bacteria,they are capable of easily injecting their DNA to target bacteria.The crispr system is packaged into phagemid vectors,in such a way that the bacteria containing the antibiotic-resistance plasmid sequence or that containing specific DNA sequences were made to be targeted.Upon crispr delivery,cas9 is programmed to recognize target sequences through the guide RNA thereby causing double-strand cleavage of targeted bacterial DNA or loss of drug resistance plasmid,which results in cell death.Remarkably,the safety and efficacy of this newly developed biotechnology tool and the biocontrol product need to be further refined for its usage in clinical translation.

关键词： crispr-cas9 Bacteriophage Phagemid Antibiotic-resistant

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