基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

作     者：李西睿 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田兴华

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：异种肝移植 基因组编辑技术 GGTA1基因 ASGR1基因 基因敲除猪 

摘      要：供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-人异种肝脏移植面临诸多障碍,其中超急性免疫排斥反应和血小板减少症是两个首要攻克难题。猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)催化形成的αGal表位抗原,与人体天然存在的αGal表位抗体结合会引发超急性免疫排斥反应。表达于猪肝窦内皮细胞和Kuffer细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因。本研究利用基因组编辑技术转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)分别介导猪GGTA1和ASGR1基因的敲除,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,在避免超急性排斥反应的同时减缓血小板减少症,以期为异种肝移植的研究提供更好的材料。本学术论文有两项研究内容,研究结果如下:1、利用TALEN技术高效制备GGTA1基因敲除五指山小型猪。针对猪GGTA1基因第4外显子设计并构建两对TALENs打靶载体,将TALEN mRNA电转染猪耳成纤维细胞,经传代培养后采用免疫磁珠法高效富集获得47个单细胞克隆,PCR测序鉴定均为GGTA1基因突变细胞,基因编辑效率高达100%。选择6种不同突变类型的GGTA1双等位基因敲除细胞为核供体进行体细胞核移植,共移植6头受体母猪,6头均妊娠至终期共产克隆仔猪23头,采集仔猪耳组织样提取基因组DNA进行PCR测序鉴定,证实全部为GGTA1基因敲除仔猪。对TALEN的17个潜在脱靶位点设计引物,PCR目的片段后测序,未发现脱靶现象。流式细胞术分析结果显示,仔猪α-Gal表位成功去除。血清裂解结果显示,GGTA1基因敲除猪细胞能够有效抵抗正常人血清的排斥反应,表明有效克服了超急性免疫排斥。上述结果表明,TALEN技术结合免疫磁珠方法可高效敲除GGTA1基因,通过体细胞核移植技术快速获得GGTA1双等位基因敲除仔猪,成功克服了超急性免疫排斥。2、本研究在GGTA1敲除的五指山小型猪基础上,利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,为异种肝移植后血小板减少症的研究提供良好的动物模型。针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞术富集表达绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,共挑取细胞克隆41个,经PCR产物测序,其中37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%;双等位基因敲除的细胞克隆30个,双等位基因敲除效率为73%。选择四个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植至4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,经PCR产物测序,所有6头仔猪均为ASGR1基因敲除猪;Western Blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,未检测到脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症。综上所述,本研究利用基因组编辑技术在猪体细胞实现了精确的基因编辑,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,克服了异种肝移植后发生的超急性免疫排斥,有望解决术后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。