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基因组编辑技术中供体DNA类型及选择

中国生物化学与分子生物学报 2017年第1期33卷 1-10页

作者：邵斯旻徐坤张智英西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

基因组编辑技术能够实现基因组的精确修饰和改造,是后基因组时代研究基因功能和遗传信息的主要手段。传统的基因打靶技术通过低效率的细胞自发同源重组实现目的基因的定点修饰。真核细胞中DNA双链断裂介导的同源重组效率远高于自发同源... 详细信息

基因组编辑技术能够实现基因组的精确修饰和改造,是后基因组时代研究基因功能和遗传信息的主要手段。传统的基因打靶技术通过低效率的细胞自发同源重组实现目的基因的定点修饰。真核细胞中DNA双链断裂介导的同源重组效率远高于自发同源重组,利用人工核酸内切酶特异性地在基因组靶序列处引入双链断裂,通过提供适当形式的、含有一定长度同源臂的供体DNA,能够实现相对高效的基因组靶向编辑。本文系统总结了环状质粒、线性化质粒、聚合酶链式反应产物及单链寡聚脱氧核苷酸4种类型的供体DNA在基因组精确编辑研究中的应用及候选原则,以期为以后相关研究中供体DNA的选择、设计提供参考和借鉴。

关键词：基因组编辑技术同源重组人工核酸内切酶供体DNA

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基因组编辑技术及其在植物遗传改良上的应用

福建农业学报 2015年第5期30卷 522-527页

作者：林雅容周淑芬朱义旺孙庆山陈惠妹王锋福建师范大学生命科学学院福建福州350108 福建省农业科学院生物技术研究所/福建省农业遗传工程重点实验室福建福州350003 福建农林大学作物科学学院福建福州350002

以类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和II型CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)为代表的基因组编辑技术,是植物基因功能研究和遗传改良的一种高效辅助工具。TALENs和CRISPR/Cas9能够精确地在植物基因组DNA序列上造成双链断裂(double strand break,DSB),激发细胞自身同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端接合(nonhomologous end-joining,NHEJ)的修复机制,从而完成对植物基因组的靶向修饰。本研究对这2种基因组编辑技术在结构特征、技术原理以及在植物靶向修饰上的应用展开了综述,并对TALENs和CRISPR/Cas9系统的应用前景进行了展望。

关键词：植物基因组编辑技术 TALENs CRISPR/Cas9

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基因组编辑技术的伦理和监管问题研究

基因组编辑技术的伦理和监管问题研究

作者：杜小鹃天津大学

学位级别：硕士

基因组编辑技术是一项新兴技术,其发展速度也是极其快的。尤其是贺建奎的“基因编辑婴儿”事件,让更多人对基因组编辑技术有所耳闻,而且人们对此技术引发的伦理问题的关注远远超过了对此技术本身的关注。本文立足于基因组编辑技术本身,... 详细信息

基因组编辑技术是一项新兴技术,其发展速度也是极其快的。尤其是贺建奎的“基因编辑婴儿”事件,让更多人对基因组编辑技术有所耳闻,而且人们对此技术引发的伦理问题的关注远远超过了对此技术本身的关注。本文立足于基因组编辑技术本身,在伦理学的视域下进行研究,最后对技术问题和伦理问题提出监管建议和措施。本文的核心论点有三个,分别是:基因组编辑技术、伦理问题和监管问题。基因组编辑技术是本文研究的一个载体,贯穿全文。对基因组编辑技术的研究主要集中在基因组编辑技术本身是什么,它的应用方向、应用范围、发展历程以及遇到的风险和机遇。对伦理问题的研究主要集中在其伦理争议,以及各要素在争议中所起到的作用,并且借用邱仁宗老师的生命伦理学理论对争议进行归因,最后从典型事件“基因编辑婴儿”中折射出的伦理争议来强化观点。最后落脚到对基因组编辑技术和此技术产生的伦理问题进行监管和治理上。

关键词：基因组编辑技术伦理问题监管

基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

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基因组编辑技术介导的猪GGTA1/ASGR1基因敲除研究

作者：李西睿河南大学

学位级别：硕士

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-... 详细信息

供体肝脏的严重短缺是限制临床肝移植的主要瓶颈,利用猪肝脏进行异种肝移植是有望解决临床供肝短缺的有效途径之一。尤其是作为“过渡肝”应用于24h内即会发生死亡的急性肝衰病人的治疗,可以降低病人的死亡率,为后续治疗争取时间。猪-人异种肝脏移植面临诸多障碍,其中超急性免疫排斥反应和血小板减少症是两个首要攻克难题。猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因(?-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)催化形成的αGal表位抗原,与人体天然存在的αGal表位抗体结合会引发超急性免疫排斥反应。表达于猪肝窦内皮细胞和Kuffer细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因。本研究利用基因组编辑技术转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-like(TAL)Effector Nucleases,TALENs)和规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)分别介导猪GGTA1和ASGR1基因的敲除,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,在避免超急性排斥反应的同时减缓血小板减少症,以期为异种肝移植的研究提供更好的材料。本学术论文有两项研究内容,研究结果如下:1、利用TALEN技术高效制备GGTA1基因敲除五指山小型猪。针对猪GGTA1基因第4外显子设计并构建两对TALENs打靶载体,将TALEN mRNA电转染猪耳成纤维细胞,经传代培养后采用免疫磁珠法高效富集获得47个单细胞克隆,PCR测序鉴定均为GGTA1基因突变细胞,基因编辑效率高达100%。选择6种不同突变类型的GGTA1双等位基因敲除细胞为核供体进行体细胞核移植,共移植6头受体母猪,6头均妊娠至终期共产克隆仔猪23头,采集仔猪耳组织样提取基因组DNA进行PCR测序鉴定,证实全部为GGTA1基因敲除仔猪。对TALEN的17个潜在脱靶位点设计引物,PCR目的片段后测序,未发现脱靶现象。流式细胞术分析结果显示,仔猪α-Gal表位成功去除。血清裂解结果显示,GGTA1基因敲除猪细胞能够有效抵抗正常人血清的排斥反应,表明有效克服了超急性免疫排斥。上述结果表明,TALEN技术结合免疫磁珠方法可高效敲除GGTA1基因,通过体细胞核移植技术快速获得GGTA1双等位基因敲除仔猪,成功克服了超急性免疫排斥。2、本研究在GGTA1敲除的五指山小型猪基础上,利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,为异种肝移植后血小板减少症的研究提供良好的动物模型。针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞术富集表达绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,共挑取细胞克隆41个,经PCR产物测序,其中37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%;双等位基因敲除的细胞克隆30个,双等位基因敲除效率为73%。选择四个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植至4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,经PCR产物测序,所有6头仔猪均为ASGR1基因敲除猪;Western Blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,未检测到脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症。综上所述,本研究利用基因组编辑技术在猪体细胞实现了精确的基因编辑,结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,克服了异种肝移植后发生的超急性免疫排斥,有望解决术后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。

关键词：异种肝移植基因组编辑技术 GGTA1基因 ASGR1基因基因敲除猪

基因组编辑技术定向改良水稻几个产量相关性状

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基因组编辑技术定向改良水稻几个产量相关性状

作者：孙庆山福建农林大学

学位级别：硕士

改良水稻产量相关性状、提高水稻产量仍是水稻育种研究的重要内容。传统的杂交育种方法改良水稻产量性状的不确定性及盲目性,大大限制了水稻产量育种水平的提高。随着大量水稻产量相关性状基因的克隆及相关生物技术的应用,特别是近几年... 详细信息

改良水稻产量相关性状、提高水稻产量仍是水稻育种研究的重要内容。传统的杂交育种方法改良水稻产量性状的不确定性及盲目性,大大限制了水稻产量育种水平的提高。随着大量水稻产量相关性状基因的克隆及相关生物技术的应用,特别是近几年发展起来的基因组编辑技术的应用,为定向改良水稻产量相关性状创造了条件。本论文拟利用基因组编辑技术定向突变几个水稻产量相关性状基因,创制一系列相关基因的突变体,观察其性状表型,探讨定点突变这些基因改良水稻相关性状的可能性及特点,为进一步筛选这些基因的优异突变等位基因新材料,开展育种利用创造条件。其主要研究结果如下:利用TALENs技术定点突变了水稻优良恢复系明恢86的株型调控关键基因IPA1。通过将抗性愈伤连续继代培养后分化,获得8种不同序列突变的IPA1突变体。自交结合PCR分析筛选到一些去除了 TALENs表达框的突变植株,已获得3种不含转基因的纯合突变体材料,其IPA1基因序列分别缺失2bp、4bp、23bp。表型分析发现,IPA1基因突变(缺失4bp)能够明显改变水稻株高及分蘖数,株高显著降低,纯合突变体平均矮化25.5cm;分蘖数明显增加,纯合突变体平均分蘖数增加4.7个。纯合突变体在明恢86遗传背景下的水稻株高平均为94.1cm,分蘖数平均为12.5 个。利用CRISPR/Cas9系统定点突变了水稻穗型调控基因DEP1、DEP3和OsLAC。在各基因编辑载体的转基因植株中,分别筛选到4种DEP1突变类型,28种DEP3突变类型和6种OsLAC突变类型。并分别获得了去除CRISPR/Cas9表达框成分的DEP1和DEP3突变体。对突变体的表型初步分析发现,DEP1突变后,穗着粒较密,穗长变短,粒型变小。在DEP3突变体中,只有缺失300bp的纯合突变体表型变化明显,穗粒数明显增多,穗着粒变密,粒长变长,粒宽变窄,长宽比达到3.2。有关OsLAC的突变体表型,DEP1和DEP3突变体的精细表型分析及DEP3不同突变体表型差异原因尚在分析中。

关键词：水稻基因组编辑技术株型穗型突变体新材料

CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用

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遗传 2015年第10期37卷 1011-1020页

作者：周金伟徐绮嫔姚婧余树民曹随忠四川农业大学动物医学院成都611130 中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室北京100101

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统,利用CRISPR RNAs(cr RNAs)引导Cas核酸酶沉默入侵的核酸。通过分子生物学改造使Ⅱ型CRISPR/Cas系统成为一种高效的基因组定点修饰技术,并且比锌指核酸酶(Zinc-fi... 详细信息

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统,利用CRISPR RNAs(cr RNAs)引导Cas核酸酶沉默入侵的核酸。通过分子生物学改造使Ⅱ型CRISPR/Cas系统成为一种高效的基因组定点修饰技术,并且比锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases,TALENs)结构更简单,更容易设计和应用。文章主要介绍了CRISPR/Cas9系统成为高效基因组定点修饰技术的发展历程、Ⅱ型CRISPR/Cas的工作原理和改造过程以及在动物基因组定点修饰的应用,剖析了该技术存在的问题和现有改进方案,并与成功案例相结合展望了CRISPR/Cas9系统的应用前景,以期为动物性状改良和人类疾病动物模型的创立提供新思路。

关键词： CRISPR/Cas9 基因组编辑技术人类疾病动物模型基因组定点修饰

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用

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植物生理学报 2015年第9期51卷 1351-1358页

作者：曾秀英侯学文华南农业大学生命科学学院植物逆境生物学研究中心广州510642 华南农业大学生命科学学院广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室广州510642

CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构,参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具,并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造... 详细信息

CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构,参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具,并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造中获得广泛应用。本文介绍CRISPR/Cas9技术出现近两年来,在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草、甜橙等植物中的研究情况,在此基础上对该技术的优点和需要进一步改进的地方提出了看法。

关键词：成簇的、规律间隔的短回文重复序列成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9 基因组编辑技术植物基因功能植物改良

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基因组编辑技术在病毒相关恶性疾病中的应用

医学分子生物学杂志 2017年第3期14卷 169-174页

作者：冯贝王黎明汪辉华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物研究中心武汉市430030

某些病毒感染人类引起相应的疾病，病毒首先通过细胞表面的受体侵入细胞内，然后利用宿主复制系统进行病毒基因组的复制、转录、翻译等完成其生活周期，组装成完整病毒，某些病毒基因组会整合到宿主基因组引起宿主细胞的过度增殖而引起... 详细信息

某些病毒感染人类引起相应的疾病，病毒首先通过细胞表面的受体侵入细胞内，然后利用宿主复制系统进行病毒基因组的复制、转录、翻译等完成其生活周期，组装成完整病毒，某些病毒基因组会整合到宿主基因组引起宿主细胞的过度增殖而引起恶性疾病。基因组编辑技术通过靶向病毒基因组，清除宿主细胞内游离或整合的病毒从根本上治愈疾病。主要从三大基因组编辑技术的作用机制以及在病毒相关疾病中的应用等方面进行阐述。

关键词：乙肝病毒人类免疫缺陷病毒人类乳头瘤病毒基因组编辑技术

基因组编辑技术及其在癌症相关基因的功能性筛选中的应用

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科学咨询(科技·管理) 2020年第3期 89-91页

作者：李雪柔南京市第二十九中学

基因组编辑工具是指可以定向改变基因组遗传物质序列的技术,目前基因组编辑技术经历了三代工具,分别是锌指核酸酶ZFN、转录激活效应物样核酸酶TALEN和规律成簇间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9系统。自从利用CRISPR/Cas9系统在高等真核生... 详细信息

基因组编辑工具是指可以定向改变基因组遗传物质序列的技术,目前基因组编辑技术经历了三代工具,分别是锌指核酸酶ZFN、转录激活效应物样核酸酶TALEN和规律成簇间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9系统。自从利用CRISPR/Cas9系统在高等真核生物中实现了基因组编辑之后,就凭借其高效和易于构建的优势成为应用最为广泛的基因组编辑工具,并在从低等到高等的多个生物体系中得到了应用。由II型CRISPR/Cas系统衍化而来的CRISPR/Cas9基因组编辑工具,通过一段短RNA(sgRNA)就可以将Cas9蛋白导向靶位点,并在特定位点引入DNA双链断裂。当sgRNA由慢病毒介导进入细胞时,则被开发出基于基因敲除的高通量功能性筛选方法学。癌症的发生是由基因突变引起的复杂疾病,随着研究者对于肿瘤细胞特点的认识越来越清楚,有很多针对癌症治疗的方法开发出来,但是进展非常缓慢,基因组编辑技术的出现给癌症的治疗带来了全新的思路。本文综述了基因组编辑技术的发展及其在癌症相关的基因研究中的应用。

关键词：基因组编辑技术 ZFN TALEN CRISPR/Cas9 功能性基因组学癌症