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gdp-甘露糖焦磷酸化酶（GMPP）的原核表达与性质的表征

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GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMPP）的原核表达与性质的表征

作者：刘项山东大学

学位级别：硕士

gdp-甘露糖是一种广泛存在于各种生物体内的糖基供体和代谢中间物，其在原核生物中主要参与O-抗原等寡糖的生物合成[1];在真核生物中主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和其他糖核苷酸生物合成的前体[2];在某些植物中参与维生素C生物合... 详细信息

gdp-甘露糖是一种广泛存在于各种生物体内的糖基供体和代谢中间物，其在原核生物中主要参与O-抗原等寡糖的生物合成[1];在真核生物中主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和其他糖核苷酸生物合成的前体[2];在某些植物中参与维生素C生物合成[3]。可见大量得到gdp-甘露糖的纯品可以为糖蛋白的生产、实验室研究提供必要的物质基础。然而在生物体内，gdp-甘露糖的含量普遍很低，通过对野生型生物材料分离纯化而得到gdp-甘露糖几乎不可能。如果能够高效表达gdp-甘露糖生物合成所需的酶系，并且对此酶系中各个酶的性质都有比较透彻的了解的话，我们则可以体外合成gdp-甘露糖。在大多数生物体中，gdp-甘露糖的生物合成途径如下[4]：由甘露糖起始，经己糖激酶催化生成甘露糖-6-磷酸，甘露糖-6-磷酸在磷酸己糖异构酶的催化下生成甘露糖-1-磷酸，以甘露糖-1-磷酸和gdp(GTP)为底物在gdp-甘露糖焦磷酸化酶作用下最终合成gdp-甘露糖。其中，对己糖激酶和磷酸己糖异构酶的性质已经研究的相对比较透彻，并且有晶体结构的报道[5]，而对gdp-甘露糖焦磷酸化酶的研究相对较少，所以本实验原核表达了大肠杆菌来源的gdp-甘露糖焦磷酸化酶并做了比较详尽的酶动力学研究。按底物种类，我们能找到两种类型的gdp-甘露糖焦磷酸化酶：类型Ⅰ(EC2．7．7．13)利用GTP和甘露糖-1-磷酸为底物，类型Ⅱ(EC 2．7．7．22)则利用gdp和甘露糖-1-磷酸为底物。参照以往的报道[6，7]，*** K12来源的gdp-甘露糖焦磷酸化酶属于类型Ⅱ，我们通过PCR技术扩增得到了来源于E coli K12的gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因cpsB，并定向克隆到原核表达载体pET-22b上，转化E coli BL21(DE3)，发酵重组菌株至指数期，加入诱导物IPTG，使gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因得到高水平表达，超声破碎细胞，上清经Ni-NTAHis·Bind(?)Resins亲和层析纯化，最后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达水平和纯度。带有His-tag的重组Cps B大小为52 kDa，在Tris-CI缓冲系统中，最适pH为7．5;Mg为该酶催化反应所必需。在最适反应条件下，以毛细管电泳检测gdp-甘露糖的生成量为指标，酶动力学分析表明Cps B既能够利用gdp，也能利用GTP，对于gdp，GTP，甘露糖-1-磷酸和gdp-甘露糖的K分别为0．9896，0．06749，0．05124和0．0209 mM，K/K分别为1．04×10，1．09×10，1．68×10和4．69×10 SmM。结合其他实验结果，最终首次提出了gdp-甘露糖焦磷酸化酶的完整的物质反应平衡。此研究不仅可以深入地了解gdp-甘露糖焦磷酸化酶催化机制，并最终为其蛋白晶体结构的解析提供必要的基本信息，还可以为gdp-甘露糖的体外合成提供重要的酶学理论基础。

关键词： gdp-甘露糖焦磷酸化酶原核表达酶动力学

多花黄精果糖激酶和gdp-甘露糖焦磷酸化酶的基因克隆及酶结构性质

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生物学杂志 2022年第4期39卷 1-6页

作者：赵历强赵德蕊单春苗张声祥施圆圆吴家文安徽中医药大学研究生院合肥230012 安徽中医药大学科研实验中心新安医学教育部重点实验室合肥230038 安徽道地中药材品质提升协同创新中心合肥230012 安徽省中医药科学院合肥230012

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和gdp-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行... 详细信息

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和gdp-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行克隆,并分析酶蛋白的理化性质及结构特点。PCFRK开放读码框(ORF)为1725 bp,编码574个氨基酸,具有两个磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序;PCGMPP的ORF为1086 bp,编码361个氨基酸,具有焦磷酸化酶家族的保守位点和活性位点。系统进化树分析发现在已知数据库中PC FRK与深圳拟兰FRK亲缘关系最近;而PC GMPP与芦笋GMPP亲缘关系最近。基因表达分析说明PCFRK和PCGMPP在根状茎中的基因表达总量明显高于其他组织,这与多花黄精根茎中多糖含量高于其他组织是一致的。研究为PCFRK和PCGMPP两种关键酶功能的进一步研究及黄精多糖生物合成途径的解析奠定基础。

关键词：多花黄精基因克隆果糖激酶 gdp-甘露糖焦磷酸化酶生物信息学分析

川黄精gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及亚细胞定位

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分子植物育种 2023年

作者：王建伟贺晓岚凯里学院理学院凯里学院大健康学院

gdp-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)在植物多糖合成中发挥重要作用，为进一步探究川黄精GMPP基因相关生物学功能，本研究从川黄精中克隆了GMPP基因且对其序列进行生物信息分析。序列分析得出，川黄精GMPP基因(命名为PkgGMPP，登录号: OR607525... 详细信息

gdp-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)在植物多糖合成中发挥重要作用，为进一步探究川黄精GMPP基因相关生物学功能，本研究从川黄精中克隆了GMPP基因且对其序列进行生物信息分析。序列分析得出，川黄精GMPP基因(命名为PkgGMPP，登录号: OR607525)cDNA编码区全长为1 086 bp，编码361个氨基酸；理化性质分析显示，PkgGMPP的分子量为39.60 kD，理论等电点为6.33，不稳定系数为34.70磷酸化酶家族成员；系统进化分析表明，该序列与多花黄精GMPP序列相似性最高；亚细胞定位结果显示，PkgGMPP定位在细胞质和细胞核上。本研究为深入探究川黄精GMPP基因的生物学功能和多糖合成机制提供一定的参考。

关键词：川黄精 gdp-甘露糖焦磷酸化酶 PkgGMPP基因序列分析亚细胞定位

魔芋gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因及其启动子的克隆与分析

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西南大学学报（自然科学版） 2019年第3期41卷 14-22页

作者：李鹏佳焦茂娟王启军苏承刚西南大学园艺园林学院/南方山地园艺学教育部重点实验室重庆400715

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编... 详细信息

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编码区长度为1 086 bp,编码的氨基酸为361个.在此基础上运用FNPI-PCR技术得到了魔芋gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP上游启动子2 116 bp,经生物信息学分析,该序列具有典型的TATA-box、 CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.

关键词：魔芋 gdp-甘露糖焦磷酸化酶启动子克隆与功能分析

选择性抑制利什曼虫源gdp-甘露糖焦磷酸化酶的结构基础及分子机制的研究

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选择性抑制利什曼虫源GDP-甘露糖焦磷酸化酶的结构基础及分子机制...

作者：李航中国科学技术大学

学位级别：硕士

利什曼病(leishmaniasis)是由利什曼原虫(Leishmania)感染引起的一种主要流行于热带和亚热带地区的传染病。据报道,每年有近100万新发利什曼病病例,近6万利什曼病死亡病例。然而,目前尚无获批上市的预防利什曼病的疫苗,临床一线用于治... 详细信息

利什曼病(leishmaniasis)是由利什曼原虫(Leishmania)感染引起的一种主要流行于热带和亚热带地区的传染病。据报道,每年有近100万新发利什曼病病例,近6万利什曼病死亡病例。然而,目前尚无获批上市的预防利什曼病的疫苗,临床一线用于治疗利什曼病的药物都带有严重的毒副作用,并己产生严重的耐药性。在此背景下,开发毒副作用小且高效的抗利什曼病特效药物具有重要意义。gdp-甘露糖焦磷酸化酶(gdp-mannosepyrophosphorylase,简称 gdp-MP)是一种已被证明的可用于开发新型抗利什曼病药物的药靶蛋白。基于药靶蛋白的结构基础设计有针对性的药物(structure-based drug design)是一种重要的药物开发策略。然而,目前并没有关于利什曼原虫源gdp-MP的实验结构的报道,这极大地制约了基于gdp-MP的结构基础的新型抗利什曼病特效药物的开发。本研究课题选取杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)的gdp-MP(Ldgdp-MP)为研究对象,利用冷冻电镜单颗粒技术,我们解析了 Ldgdp-MP及其与GTP或gdp-Man的复合体的高分辨率结构。通过结构分析并辅以生化实验,我们阐述了 Ldgdp-MP的生物催化和活性调控的分子机制,为基于gdp-MP的结构基础的新型抗利什曼病特效药物的开发提供了理论支撑。实验结果表明,Ldgdp-MP是一个稳定的同六聚体,每个单体包括了一个N端催化结构域和一个C端缔合结构域。N端催化结构域是一个Rossmann-fold类似结构域,该结构域拥有完整的活性口袋,通过结构分析并辅以生化实验,我们确定了在催化过程中发挥关键作用的残基,提出了 Ldgdp-MP的生物催化的分子机制。C端缔合结构域是一个左手螺旋的β-helix结构域,Ldgdp-MP的每一个亚基通过C端缔合结构域形成的interface-1和interface-2这两种不同的相互作用与空间上相邻的两个亚基相接触。结构分析表明,interface-1稳定了生物催化所必要的signature motif的构象。为了探寻Ldgdp-MP独特的四级结构背后蕴含的生物学意义,我们设计了一些突变破坏interface-1的相互作用,这些突变导致Ldgdp-MP的四级结构发生改变,并且丧失了生物学活性,这证明了亚基间的相互作用是Ldgdp-MP发挥催化活性的前提。基于此发现,我们提出了 interface-1对Ldgdp-MP的生物学活性的调控机制。通过将Ldgdp-MP与其他物种的gdp-MP进行结构比对,我们发现虽然gdp-MP的单体结构尤其是活性中心在进化中高度保守,但是不同物种的gdp-MP却呈现出迥异的四级结构。细菌的gdp-MP以简单的C2对称的方式形成尾对尾的同二聚体,两个亚基在功能上相对独立。原生动物的gdp-MP以D3对称的方式形成同六聚体,其亚基间相互作用可以对gdp-MP的活性进行调控。人类的gdp-MP则形成更为复杂的异十二聚体,调控机制更为复杂。本课题解析了首个利什曼虫源gdp-MP的结构,并阐述了它的生物催化和活性调控的分子机制,这为基于gdp-MP的结构基础的新型抗利什曼病药物的开发提供了理论基础。此外,本课题还从结构生物学角度剖析了从细菌进化至原生动物再进化至高等哺乳动物人类的过程中,gdp-MP的四级结构及调控机制的演变过程。

关键词： gdp-甘露糖焦磷酸化酶利什曼病利什曼原虫冷冻电镜结构蛋白质进化

超表达番茄gdp-D-甘露糖焦磷酸化酶基因马铃薯对温度胁迫的响应

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中国农业科学 2011年第23期44卷 4952-4961页

作者：李超汉李青竹史庆华白龙强郭晓青李霞于贤昌中国农业科学院蔬菜花卉研究所山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室

【目的】研究番茄gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)在马铃薯中的超表达对其抵御温度胁迫能力的影响。【方法】利用已经获得的超表达番茄GMPase的两个转基因马铃薯株系,用野生型马铃薯作对照,比较其在常温(25/20℃)、温度胁迫(10/5℃低... 详细信息

【目的】研究番茄gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)在马铃薯中的超表达对其抵御温度胁迫能力的影响。【方法】利用已经获得的超表达番茄GMPase的两个转基因马铃薯株系,用野生型马铃薯作对照,比较其在常温(25/20℃)、温度胁迫(10/5℃低温处理3 d,35/30℃高温处理3 d)及25/20℃恢复3 d后GMPase的相对表达量、抗坏血酸(AsA)含量及其相关生理指标的变化。【结果】在常温、温度胁迫与恢复阶段,与野生型植株相比,转基因马铃薯植株具有较高的GMPase相对表达量、GMPase活性、AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量;高温和低温胁迫后,转基因马铃薯的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAHR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均明显提高,丙二醛(MDA)和H2O2含量及细胞质膜透性均明显降低。【结论】番茄GMPase在马铃薯中的超表达可能有提高马铃薯植株抵御温度胁迫的能力。

关键词：马铃薯抗坏血酸 gdp-甘露糖焦磷酸化酶转基因温度胁迫

药用植物质量标志物多糖生物合成通路及关键酶研究进展

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中草药 2021年第15期52卷 4752-4762页

作者：李晓岗张雪俞捷王希付代红洋陈嘉伟许均博曹冠华贺森云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室云南昆明650500 云南中医药大学云南省傣医药与彝医药重点实验室云南昆明650500

多糖是众多药用植物中重要的质量标志物,在免疫调节、抗肿瘤等方面具有显著的药理作用。多糖是一类结构复杂、种类繁多、组合多样的生物大分子,其生物合成通路主要包括蔗糖转化、尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖至其... 详细信息

多糖是众多药用植物中重要的质量标志物,在免疫调节、抗肿瘤等方面具有显著的药理作用。多糖是一类结构复杂、种类繁多、组合多样的生物大分子,其生物合成通路主要包括蔗糖转化、尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖至其他NDP单糖的转化、多糖聚合3个部分。在这一合成过程中涉及的关键酶主要包括蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)、果糖-6磷酸酯在蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)、蔗糖由转化酶(invertase,INV)、己糖激酶(hexokinase,HK)、果糖激酶(fructokinase,FRK)、UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)、UDP-鼠李糖合成酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)、磷酸甘露糖突变酶(phosphomannose isomerase,PMM)、gdp-甘露糖焦磷酸化酶(gdp-mannose pyrophosphorylase,GMPP)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)等。选取以多糖为主要质量标志物的药用植物为探讨对象,对其多糖生物合成通路、关键酶作用机制及单糖组成进行归纳分析,并对研究中存在的问题和可能的解决思路进行了梳理和展望。对明确药用植物质量标志物多糖生物合成通路,了解关键酶作用机制具有一定的参考价值。

关键词：药用植物多糖生物合成通路蔗糖合成酶蔗糖磷酸合成酶转化酶己糖激酶果糖激酶 UDP-葡萄糖脱氢酶 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 UDP-葡萄糖-4 6-脱氢酶磷酸甘露糖异构酶 gdp-甘露糖焦磷酸化酶糖基转移酶

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第3期42卷 191-196页

作者：夏惠张敏马锋旺四川农业大学果蔬研究所四川成都611130 西北农林科技大学园艺学院陕西杨凌712100

【目的】克隆苹果gdp-甘露糖焦磷酸化酶(gdp-mannose pyrophosphorylase,GMP)、gdp-甘露糖-3′,5′-表异构酶(gdp-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和gdp-1-半乳糖磷酸酶(gdp-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。

关键词：苹果 gdp-甘露糖焦磷酸化酶 gdp-甘露糖-3′,5′-表异构酶 gdp-1-半乳糖磷酸酶抗坏血酸

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水稻OsVTC1基因的表达特性与功能分析

水稻OsVTC1基因的表达特性与功能分析

作者：邓载安海南大学

学位级别：硕士

维生素C (Vitamin C,Vc),又称抗坏血酸(ascorbic acid, AsA),在许多动物和植物中具有重要功能。人类及部分动物因为体内古洛糖内酯氧化酶突变而导致不能自主合成AsA,需要从食物中获取。植物AsA是人类补充AsA的重要来源。尽管在双子叶模... 详细信息

维生素C (Vitamin C,Vc),又称抗坏血酸(ascorbic acid, AsA),在许多动物和植物中具有重要功能。人类及部分动物因为体内古洛糖内酯氧化酶突变而导致不能自主合成AsA,需要从食物中获取。植物AsA是人类补充AsA的重要来源。尽管在双子叶模式植物拟南芥中的研究表明L-半乳糖途径可能是植物AsA合成的主要途径,但在单子叶植物如重要粮食作物水稻中L-半乳糖途径关键酶基因的特性和功能还不清楚。gdp-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)是拟南芥L-半乳糖途径AsA合成的关键酶之一。GMP的点突变体vtcl的AsA含量约为野生型的25%-30%。利用拟南芥AtVTC1蛋白进行同源比对,发现水稻中有三个基因编的蛋白与该酶具有极高相似性。为此,本实验主要研究了这三个基因的表达特性,并初步分析了这三个基因在AsA合成中的作用。结果如下：(1)克隆AtVTC1的三个水稻同源基因OsVTC1L-1, OsVTC1L-3,OsVTC1L-8。三个基因相似度为87%其,中OsVTC1L-1与OsVTC1L-8相似度高达90%。(2)构建原核表达载体,利用原核表达技术,纯化这三个基因的重组蛋白,发现这三个基因的重组蛋白都有GMP的活性.(3)利用Real-time PCR技术,检测野生型水稻(日本晴)中这三个基因表达变化特性及持续光、暗条件处理后基因表达与AsA含量变化的相关性。发现OsVTC1L-1与AtVTC1的表达特性具有更高的一致性.(4)构建这三个基因的过表达载体,转化拟南芥的突变体vtc1-1,鉴定阳性转基因植物,检测到过表达OsVTC1L-1, OsVTC1L-3的阳性植株的AsA含量升高,而过表达OsVTC1L-8的AsA含量没有显著变化;(5)采用RNA干扰技术,在水稻中抑制三个基因表达,已经分别获得RNAi-OsVTC1L-1/8和RNAi-OsVTC1L-3转基因干扰株系。检测发现,RNAi-OsVTC1L-1/8株系AsA的含量降低,而RNAi-OsVTC1L-3株系AsA的含量没有明显变化。初步实验结果表明OsVTC1L-1参与水稻的AsA合成,且是水稻叶片中GMP活性主要贡献者。

关键词：维生素C/抗坏血酸 L-半乳糖途径 gdp-甘露糖焦磷酸化酶 RNA干扰