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作者：吴先华湖南大学

学位级别：硕士

细胞膜是细胞的重要屏障和细胞间通讯场所,蛋白酶、受体、气体分子、离子、细胞因子等生物分子在细胞膜表面通过直接或间接相互作用启动细胞信号传导。开发可定位细胞膜、实时监测细胞分泌、代谢和细胞间通讯的传感检测工具,有助于我们... 详细信息

细胞膜是细胞的重要屏障和细胞间通讯场所,蛋白酶、受体、气体分子、离子、细胞因子等生物分子在细胞膜表面通过直接或间接相互作用启动细胞信号传导。开发可定位细胞膜、实时监测细胞分泌、代谢和细胞间通讯的传感检测工具,有助于我们加深对细胞生理、病理过程的理解,发展新的诊断、治疗方法。细胞膜所处的细胞微环境组分复杂,生物分子的变化具有微弱和快速的特点,因此实时定量测量细胞膜表面的信号分子仍具有挑战性。荧光共振能量转移(fret)传感器作为高灵敏探测生物大分子结构的“分子标尺”,广泛应用于监测细胞内离子浓度、酶活性、蛋白质相互作用与构象变化等微观事件。基于荧光蛋白(Fluorescent protein,FP)的fret传感器具有高灵敏度和生物相容性的优点,可实现在细胞内高时空分辨可视化检测。基于FP的fret传感器主要由蛋白-蛋白联用的fret对组成,通常可在融合蛋白之间设计传感模块。fret对的形成对于供受体的光谱重叠程度和两者的空间距离要求十分严格,目前性能优越的基于FP的fret对仍然有限。基于核酸适配体的fret传感器易于合成设计,但修饰荧光团的价格昂贵,最新的替代策略为开发基于核酸适配体和小分子的荧光核酸复合物。综合蛋白质功能的多样性和核酸的可编程性,开发蛋白-核酸联用的蛋白核酸嵌合物fret对,集成功能强大的蛋白模块与核酸模块,可为设计新型多功能fret生物传感器提供更多研究思路。为开发用于细胞膜表面原位分析的蛋白核酸嵌合物fret探针,我们选择大斯托克斯位移荧光蛋白m Ametrine和荧光核酸复合物G4(1a)分别作为fret对的供受体,以高效特异性切割连接单链DNA(ss DNA)的DCV作为蛋白核酸嵌合物连接元件,将融合蛋白和荧光核酸复合物组装成fret对。蛋白核酸嵌合物fret对的优越性在于蛋白和核酸部分均可进行传感设计。受体G4(1a)含有与HSO的反应位点,反应后可致受体荧光淬灭从而解除fret。此外,在fret探针的融合蛋白之间设计蛋白酶底物位点,酶切后可使受体远离供体从而解除fret。在蛋白核酸嵌合物fret探针的蛋白模块融合插膜肽MIP可构建定位细胞膜的多功能fret探针,为分析细胞膜表面生物分子信号提供了新的研究思路。本文为构建可定位细胞膜原位分析的蛋白核酸嵌合物fret探针做了以下研究工作:(1)蛋白核酸嵌合物fret对的构建以及性能优化。构建重组质粒p ET28a-mip-m Ametrine-dcv,并在原核体系中表达重组供体蛋白MIP-m Ametrine-DCV。验证其荧光性质和切割连接ss DNA的能力,并构建了蛋白核酸嵌合物fret对MIP-m Ametrine-DCV-G4(1a)。通过对蛋白与核酸的共价连接反应条件和重组蛋白的结构进行优化,获得fret对MIP-m Ametrine(s)-DCV-G4(1a),使fret效率从47%提高至67%。(2)蛋白核酸嵌合物fret探针用于检测细胞膜表面HSO。细胞内源性SO参与心血管系统的稳态控制,经代谢后转化成亚硫酸氢盐(HSO),监测细胞膜表面HSO信号变化有助于了解相关疾病的病理机制。荧光核酸复合物G4(1a)的小分子配体1a处于缺电子状态,可与亲核试剂HSO发生反应,使其自身荧光淬灭。基于此性质,我们将第二章构建的fret对MIP-m Ametrine(s)-DCV-G4(1a)应用于检测HSO。构建的fret探针可特异性响应HSO,检测限低至0.34μM。插膜肽MIP可将fret探针定位于细胞膜,实现了对细胞膜表面HSO的检测,有望进一步实现对内源HSO的检测,为构建定位细胞膜的传感平台提供了一种有潜力的工具。(3)蛋白核酸嵌合物fret探针用于检测细胞膜蛋白酶Furin活性。弗林蛋白酶(Furin)在多种癌症细胞中表达量上调,是一种癌症标志物。监测细胞膜Furin活性对相关疾病的早期诊断和预后具有重要意义。基于蛋白核酸嵌合物的多功能性,我们在融合蛋白的m Ametrine(s)-DCV之间的linker上设计Furin底物序列,构建了可特异性响应Furin的fret探针MIP-m Ametrine(s)-furin-DCV-G4(1a)。fret探针被Furin特异性识别切断后,供受体分离,以引起的荧光信号变化表征Furin活性,检测限低至6.7×10 U/μL。同时,该fret探针实现了在细胞裂解液复杂生理环境中分析Furin活性,有望进一步将其应用于原位分析细胞膜表面Furin活性,为构建原位分析的多功能细胞膜生物分子检测平台奠定了基础。

关键词：蛋白核酸嵌合物 fret探针 DCV 细胞膜 HSO3- Furin

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基于fret原理构建AtLHT1转运底物筛选探针

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华南农业大学学报 2022年第1期43卷 77-84页

作者：李志伟李本杰刘志兵林菲徐汉虹舒薇华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室广东广州510642 华南农业大学测试中心广东广州510642

【目的】为提高导向药物筛选通量,加快导向农药分子设计、合成、筛选等研发速度,构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白AtLHT1的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,fret)探针作为导向农药筛选平台。【方法】构建CFP-LHT1... 详细信息

【目的】为提高导向药物筛选通量,加快导向农药分子设计、合成、筛选等研发速度,构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白AtLHT1的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,fret)探针作为导向农药筛选平台。【方法】构建CFP-LHT1-YFP的三明治探针,分别在大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)原核细胞和BY4741酵母细胞中进行表达、鉴定和纯化。采用荧光酶标仪和激光共聚焦检测fret效率的变化。【结果】CFPAtLHT1-YFP融合蛋白探针纯化后,分别与供试氨基酸和草甘膦混合,供试氨基酸和草甘膦的加入导致探针蛋白的fret比率发生明显变化,草甘膦处理使D535 nm/D480 nm升高7%~12%,其变化趋势与阳性配体甘氨酸和谷氨酸接近,而加入阴性配体精氨酸则没有明显变化。同时,fret比率呈现底物浓度依赖。样品中分别加入1、5和30 mmol/L的草甘膦溶液,20 min后检测到D535 nm/D480 nm分别升高3%、1%和13%,阳性配体也存在fret比率随着底物浓度上升而升高的趋势,而阴性配体变化不规则。利用光漂白法检测到氨基酸或草甘膦处理后单个酵母细胞的fret效率发生明显变化。加入阳性对照的甘氨酸和谷氨酸后,fret效率变化明显,其中,甘氨酸和谷氨酸的fret效率分别达到30%和26%;加入草甘膦处理的fret效率与谷氨酸接近,达26%;含PBS的空白对照组没有明显的fret效率变化。【结论】AtLHT1-fret探针可以与中性氨基酸甘氨酸和酸性氨基酸谷氨酸结合,但不结合碱性氨基酸精氨酸;fret效率因不同底物有所差异,且具有一定的底物浓度依赖性;同时,证明了草甘膦能够被氨基酸转运蛋白AtLHT1转运。

关键词：荧光共振能量转移 AtLHT1 fret探针导向农药

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CD147糖基化水平检测的基因编码的fret荧光探针的设计、构建及其活细胞成像研究

CD147糖基化水平检测的基因编码的FRET荧光探针的设计、构建及其...

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作者：卢慧中国科学技术大学

学位级别：硕士

CD147能诱导成纤维细胞以及肿瘤细胞分泌细胞外基质金属酶,因此又被称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。CD147不仅能促进癌细胞分泌MMPs从而促进肿瘤的侵袭还能促进癌细胞增值并参与炎症反应、胚胎发育、伤口愈合、炎症、动脉粥样硬化... 详细信息

CD147能诱导成纤维细胞以及肿瘤细胞分泌细胞外基质金属酶,因此又被称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。CD147不仅能促进癌细胞分泌MMPs从而促进肿瘤的侵袭还能促进癌细胞增值并参与炎症反应、胚胎发育、伤口愈合、炎症、动脉粥样硬化、关节炎等多种生理过程且广泛表达于各种细胞表面。而CD147糖基化水平与CD147的功能密切相关。大量研究表明CD147属于N-连接的糖蛋白,且CD147经过糖基化修饰后分子量差异比较大,没有经过糖基化的CD147核心分子质量有27kDa,经过糖基化修饰之后分子量在43到66kDa之间,因此糖链占据了 CD147分子量的一大部分。根据CD147糖基化水平的高低可将CD147划分为高糖基化水平的CD147(HG-CD147)和低糖基化水平的CD147(LG-CD147)。研究表明高度糖基化的CD147才能诱导MMPs的分泌,而CD147的高糖基化形式和低糖基化的比例影响CD 147的功能以及癌细胞的侵袭迁移能力。且其糖基化可能对于CD147向细胞表面的转运以及细胞膜上成熟CD147的活性至关重要。但是目前检测活细胞中CD147糖基化水平的手段一片空白。因此基于CD147糖链的成分以及fret原理,我们设计了一系列由基因编码的多肽探针:CFP-S100A9、CFP-Caveolin-1、YFP-E-selectin 以及YFP-P-HAL,其中 S100A9 和 Caveolin-1 特异性结合 CD147 蛋白本身,E-selectin和P-HAL结合糖链。通过活细胞共定位等实验最终筛选出一对能够在活细胞水平检测CD147糖基化水平的变化,而且是特异性的检测CD147的糖基化的探针:CFP-S100A9和YFP-E-selectin。此外,这对探针能够达到在活细胞水平实时检测到CD147糖基化水平动态变化的效果。因此,利用这对探针检测CD147糖基化水平的变化有利于深入研究活细胞水平的CD147糖基化参与肿瘤转移等病理过程中的相关机制。

关键词： CD147 糖基化 fret探针

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定向迁移细胞前沿α4整合素对Rac局部化激活的分子调控机制

定向迁移细胞前沿α4整合素对Rac局部化激活的分子调控机制

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作者：李思锐湖南师范大学

学位级别：硕士

本研究项目根据已发表的,激活的整合素α4在细胞尾部、两侧,负调控Rac活性的信号转导通路的研究结果,结合相关信号分子的结构、功能,提出在细胞前沿,整合素正调控Rac活性的信号转导通路,即当α4胞内区域磷酸化进而抑制其与paxillin结合... 详细信息

本研究项目根据已发表的,激活的整合素α4在细胞尾部、两侧,负调控Rac活性的信号转导通路的研究结果,结合相关信号分子的结构、功能,提出在细胞前沿,整合素正调控Rac活性的信号转导通路,即当α4胞内区域磷酸化进而抑制其与paxillin结合时,paxillin、GIT1,与PIX、PAK形成信号分子复合物。由于PAK为Rac的效应分子,PIX为Rac的转换分子,构成了paxillin-GIT1-PIX-PAK信号转导通路,从而促使Rac1在细胞前沿持续的局部化激活,导致片状足的形成,产生细胞向前迁移推动力的全新构想。首先我们将验证hFN对Rac蛋白的激活,然后我们将采用免疫印迹实验,初步证明这些蛋白在细胞前沿存在两两相互作用,即该处存在这样的信号分子复合物,进而通过荧光双定位验证这些分子间的相互作用可以发生在细胞前沿,最后通过fret单分子探针,实时、定量高分辨率的监测Rac的激活时空变化图像。

关键词：激光共聚焦显微镜技术 Rac蛋白激活免疫印迹 fret探针荧光双定位

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γ-氨基丁酸探针构建及其在菌体筛选和多环芳烃致病机制中的应用研究

γ-氨基丁酸探针构建及其在菌体筛选和多环芳烃致病机制中的应用...

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作者：胡巧重庆科技学院

学位级别：硕士

石油作为一个国家重要的能源物质,对保障国家经济、社会发展以及国防安全有着不可估量的作用。但石油开发和利用过程中一系列的环境问题也不得不引起我们的重视。石油中的烃类污染物进入大自然的循环系统,污染土壤、水产品和农产品等,... 详细信息

石油作为一个国家重要的能源物质,对保障国家经济、社会发展以及国防安全有着不可估量的作用。但石油开发和利用过程中一系列的环境问题也不得不引起我们的重视。石油中的烃类污染物进入大自然的循环系统,污染土壤、水产品和农产品等,通过食物链富集于人体中,诱发抑制性神经递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的浓度变化,造成相关疾病的发生。有效的解决石油烃类物质的危害,需要从以下两个方面进行深入研究:一是进一步发展石油污染的修复技术,实现高效、环保的修复和治理石油污染物;二是加强对石油污染物的致病机制研究,为预防和早期治疗相关疾病打下基础。首先,本课题基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,fret）技术设计了针对GABA的探针VFT1。这一探针的结构包括了GABA的配体结合区（VFT）,linker序列和ECFP/Ypet荧光蛋白对序列。利用亚克隆技术构建了适合在大肠杆菌中表达的重组质粒,通过琼脂糖凝胶电泳和测序验证了重组质粒的大小。并将重组质粒转导至大肠杆菌中表达出探针蛋白,采用镍基质亲和层析法纯化了探针蛋白。通过蛋白质免疫印迹（Western blot）结果验证了表达纯化的蛋白探针大小,荧光光谱实验验证了蛋白形式探针的功能和动态响应能力。该探针蛋白能于体外对GABA以及GABA激动剂巴氯芬（Baclofen,Bac）产生一定程度的响应。然后,以进一步发展和推广石油污染的微生物修复技术为目标,针对微生物修复技术中菌种筛选复杂的问题,建立快速筛选和评价石油降解菌性能的工具。构建了适合在大肠杆菌和枯草杆菌表达的重组质粒。表达VFT1探针在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌活体细胞中监测到了GABA信号,此外,通过检测细菌代谢环境响应因子GABA的浓度变化评价了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对不同环境模型（酸性、碱性和盐环境）的适应性。VFT1探针从细菌代谢活性方面评价了菌种的环境适应性,相较于传统的菌种数量等筛选方式,提供了一种更精准的评价工具。接着,由于GABA是重要的抑制性神经递质,与石油污染物多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）的神经毒性和神经发育毒性的致病机制有着密切联系。所以监测组织中GABA浓度和分布的变化具有重要意义。将基于fret的GABA探针孵育脑切片和视网膜切片,检测到CA1区和视网膜中GABA的释放。在苯并芘染毒的海马组织模型中监测了GABA的释放,探究苯并芘对海马组织中GABA释放浓度的影响。VFT1探针能以蛋白形式在组织切片中监测到GABA的浓度和分布,可用于体外评价GABA的释放,为探究PAHs的致病机制以及相关疾病的预防打下基础。最后,为了更进一步实现活细胞内实时监测细胞GABA信号,我们还构建了基于单荧光的GABA探针GABA-SFP,并对该探针在细胞膜上的表达及功能进行评价。研究开发了针对GABA的遗传编码单荧光探针,这将有利于探索PAHs对GABA浓度和分布的影响,为研究PAHs具体致病机制,相关预防和治疗药物的研发打下基础。综上所述,本论文围绕GABA研发了两款基于荧光蛋白的生物探针VFT1和GABASFP,为石油污染修复中菌种快速筛选评价和石油污染物PAHs致病机制研究提供了研究工具。我们分析GABA受体和荧光蛋白的基因序列,利用亚克隆技术构建重组质粒,通过目的蛋白表达、荧光光谱检测、fret成像等方式验证了探针性能,制备出能在体内、体外稳定表达成像的GABA探针,并应用于不同环境模型中评价了大肠杆菌和枯草杆菌的代谢活性,成功于组织切片中监测到了GABA信号的释放。为石油降解菌性能快速筛选评价、探究PAHs暴露的致病机制以及相关预防和早期药物疗效评价提供新的研究思路。

关键词： γ-氨基丁酸 fret探针微生物修复技术菌种筛选多环芳烃

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基于单波长激发的定量fret成像

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激光生物学报 2018年第4期27卷 326-331页

作者：魏丽春苏文华陈同生华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室广东广州510631

本文发展了一种针对于固定fret质粒的单波长激发的E-fret方法(SDW-E-fret)。相比于Efret方法,SDW-E-fret只需要测量供体激发时供体通道的荧光强度(IDD)和fret通道的荧光强度(IDA),因此该方法可以实现活细胞的快速定量fret成像。结合双... 详细信息

本文发展了一种针对于固定fret质粒的单波长激发的E-fret方法(SDW-E-fret)。相比于Efret方法,SDW-E-fret只需要测量供体激发时供体通道的荧光强度(IDD)和fret通道的荧光强度(IDA),因此该方法可以实现活细胞的快速定量fret成像。结合双通道荧光显微成像系统,该方法无需任何机械切换,定量fret成像的速度只取决于CCD相机的成像速度,因而特别适合活细胞实时动态定量fret成像。在本研究小组发展的双通道荧光显微镜平台上,应用SDW-E-fret方法测量了C5V和C17V的fret效率,得到了与其它方法测量的一致的结果。

关键词：定量fret成像 fret探针单波长激发实时测量活细胞

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