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fbxw10促进ANXA2泛素化介导男性肝癌恶性进展的机制研究

FBXW10促进ANXA2泛素化介导男性肝癌恶性进展的机制研究

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作者：刘泽宇中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的肝癌是一种高度侵袭性的原发性恶性肿瘤,是世界范围内第三大癌症死亡原因,患病率居第六位。肝癌主要包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌和混合性肝癌三种类型,其中肝细胞癌占肝癌总数的75-85%。研... 详细信息

研究背景和目的肝癌是一种高度侵袭性的原发性恶性肿瘤,是世界范围内第三大癌症死亡原因,患病率居第六位。肝癌主要包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌和混合性肝癌三种类型,其中肝细胞癌占肝癌总数的75-85%。研究发现在非生殖系统恶性肿瘤中,男性和女性患者发病率与死亡率具有显著的性别偏移。在肝癌中,男性患者的发病率和死亡率约是女性患者3倍。但男性比女性更易患肝癌的机制至今尚不清楚。早期研究认为男性不良生活习惯的相关因素是导致男性肝癌发病率高的主要原因。然而近年来组学研究发现,男性特异性基因或蛋白升高可能是促进肝癌发生发展的主要因素,但具体分子机制目前尚无报道。泛素化修饰是翻译后修饰(Post Translational Modifications,PTMs)的一种常见类型,在蛋白质降解、激活及稳定中发挥重要作用。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)通过一系列酶促反应发挥其生物学功能,包括泛素激活酶E1启动泛素激活,并将泛素转移到泛素结合酶E2,E2最终与泛素-蛋白E3连接酶结合,催化特定底物的泛素化修饰。fbxw10属于fbxw亚群(富含WD重复域),是E3泛素连接酶复合物中的底物识别蛋白亚基F-box,参与底物识别和蛋白泛素化降解或活化。我们最新研究发现E3泛素连接酶fbxw10在肝癌中异常高表达,且与男性患者预后呈负相关,与女性患者无关。但fbxw10如何促进男性肝癌恶性进展的分子机制尚不清楚。研究方法1.利用蛋白质组学与蛋白质泛素化修饰组学分析fbxw10-Tg(+)雄性与雌性小鼠肝癌组织中泛素化差异蛋白,结合免疫共沉淀(Co-IP)实验明确与fbxw10相互结合的潜在蛋白,通过维恩图交叉筛选出泛素化上调互作蛋白ANXA2(Lys148)、FASN和RPL13A。通过临床预后与CCK-8细胞功能实验,明确ANXA2是否是fbxw10介导男性肝癌发生的关键分子。2.利用体内泛素化实验明确fbxw10介导ANXA2泛素化靶位点及多聚赖氨酸修饰链类型。结合免疫荧光、Transwell和CCK-8实验明确ANXA2及其靶位点对fbxw10介导的肝癌细胞增殖与迁移的作用。3.利用磷酸化修饰组学分析fbxw10-Tg(+)雄性与Wild-type雄性小鼠肝癌组织,明确fbxw10异常高表达时ANXA2发生磷酸化的潜在位点。结合Co-IP、体内泛素化、免疫荧光、Transwell和CCK-8实验明确ANXA2磷酸化位点与功能活性的关系。4.通过查阅文献及GSEA软件富集分析明确与ANXA2显著相关的信号通路,结合Co-IP和Western blot实验明确fbxw10是否通过激活ANXA2,从而上调下游信号通路。5.利用裸鼠肝原位移植肿瘤模型明确抑制ANXA2是否可以逆转fbxw10驱动的雄性肝癌发展和肺转移。6.利用免疫组化染色分析BXW10和ANXA2蛋白在男性和女性患者中的表达情况,通过统计分析明确fbxw10和ANXA2对男性和女性肝癌患者预后的影响。研究结果***2与fbxw10特异性结合,并在Lys148位点发生K63型泛素化修饰,从而提高ANXA2膜定位水平。2.下调ANXA2抑制fbxw10介导的肝癌细胞增殖和迁移(Pfbxw10无法激活ANXA2促进肝癌细胞增殖及迁移(Pfbxw10结合并泛素化和活化ANXA2。活化的ANXA2可与KRAS结合,上调p-ERK,激活MEK/ERK和EMT通路。4.体内实验证实,敲低ANXA2可显著抑制fbxw10驱动的雄性小鼠肝癌发展和肺转移(Pfbxw10和ANXA2在男性肝癌中表达显著相关(Pfbxw10和ANXA2共同高表达提示男性肝细胞癌患者预后不良(Pfbxw10与ANXA2在男性HCC组织中高表达,与不良预后正相关。S6K1通过促进fbxw10识别并泛素化ANXA2,激活KRAS和MEK/ERK信号通路,促进男性肝癌恶性进展。

关键词： fbxw10 ANXA2 S6K1 KRAS 泛素化修饰肝细胞癌

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fbxw10促进肝细胞性肝癌发生发展和不良预后的研究

FBXW10促进肝细胞性肝癌发生发展和不良预后的研究

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作者：罗袁登中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

背景和目的:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有近百万例新增肝癌病例和新增肝癌相关死亡病例。肝癌主要包括两种病理类型:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,由肝细胞恶变而来)占肝癌总数的75-85%。目前认为,HCC... 详细信息

背景和目的:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有近百万例新增肝癌病例和新增肝癌相关死亡病例。肝癌主要包括两种病理类型:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,由肝细胞恶变而来)占肝癌总数的75-85%。目前认为,HCC唯一可能根治的方式有两种:肝移植和手术切除。但是即使行手术或者肝移植治疗,患者仍有较高的复发率,同时,部分患者因症状不明显,在发现肿瘤时已经无法手术。对于这样的患者,目前我们目前仍缺乏有效的治疗手段。因此,探寻HCC发生的机制,寻找新的治疗靶点显得尤为重要。泛素化于细胞功能的任何方面都发挥重要作用,如细胞增殖、细胞周期、进展、转录和凋亡等方面。泛素化能调控关键信号通路的靶蛋白降解和翻译后修饰。泛素化作为一种酶级联反应,它及其相关的功能蛋白被称为泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)。体内UPS整个过程包括三种主要酶:泛素激活酶(Ubiquitin activating enzyme,E1,其作用是活化泛素),泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2,其作用是传递泛素)和泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3,其作用是特异性地将泛素与底物蛋白结合)。Cullin-RING E3连接酶是最大的E3泛素连接酶家族,SCF型E3泛素连接酶是该家族的成员之一。SCF型E3泛素连接酶是由Skp1/cullin1/Rbx1和F-box蛋白组成的蛋白复合体。F-box蛋白通过其WD重复或富含亮氨酸的重复序列特异性地识别并底物结合,从而达到泛素化修饰并间接目的蛋白的作用。根据F-box蛋白存在的特定底物识别域,将其划分为三个不同的亚群:FBXL亚群(富含亮氨酸重复结构域)、fbxw亚群(富含WD重复结构域)、和FBXO亚群(其它结构域)。不同的F-box蛋白结合不同的底物,发挥不同的功能。大多数研究表明F-box蛋白介导的蛋白降解失调将导致人类恶性肿瘤,表明F-box蛋白与肿瘤发生发展有关。fbxw10是F-box蛋白fbxw亚群成员之一。据报道,它与透明细胞性肾细胞癌的异常甲基化相关。fbxw10也可能参与belinostat抑制鳞状细胞性肺癌(lung squamous cell carcinoma,LSCC)的相关机制。但其对肝脏肿瘤的作用尚未见报道。因此,我们目前的研究目的是利用TCGA的临床数据和一系列的实验来研究fbxw10是否会影响HCC的发生发展以及fbxw10对HCC预后的作用。方法:1.利用从TCGA数据库中下载的数据(191个HCC病例及其资料)来分析fbxw10与临床特征特别是肿瘤发生和生存概率的关系。2.选取21例HCC组织及2例正常肝组织进行RT-RCR,以验证fbxw10 mRNA在HCC中的表达情况。3.选取28例HCC组织进行免疫组织化学染色验证fbxw10的蛋白在HCC中表达情况。***10转基因过表达小鼠被用来验证其对于肝脏肿瘤发生的作用。5.进一步明确通过转染小干扰RNA(Small interfering RNA,SiRNA)抑制fbxw10(将fbxw10的SiRNA应用于肝癌细胞系)后,肝癌细胞生长和侵袭转移的情况。结果:1.通过对癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库进行分析,首先建立了Cox风险回归模型表明了fbxw10的表达水平是影响HCC预后的独立危险因素(p=0.001)。临床相关性分析发现fbxw10的表达水平与HCC患者的性别(Chi-square检验,p=0.009)和血管侵犯(Chi-square检验,p=0.017)相关。以不同性别分组,进行临床相关性亚组分析后发现fbxw10的表达水平仅与男性HCC患者的血管侵犯有关(Chi-square检验,p=0.045)。通过kaplan-Meier生存分析发现只有高表达fbxw10的男性HCC患者才会有较短的生存时间(log-rank检验,p=0.0022)。通过RT-RCR实验比较了男性HCC组织与正常肝组织中fbxw10 mRNA的表达丰度,发现fbxw10高表达与HCC组织中(17/21),进一步对男性HCC患者的癌组织与癌旁组织进行免疫组织化学染色分析发现fbxw10过表达于男性HCC患者的癌组织中(22/28)。2.通过构建fbxw10过表达的C57BL/6小鼠,并利用利用二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,DEN)联合四氯化碳(CCl)的方式诱导小鼠肝癌模型,发现fbxw10过表达的雄性小鼠较fbxw10野生型雄性小鼠更易发生肿瘤,肝细胞的再生能力明显减弱,肝脏损伤和炎症反应明显加重。3.通过转染SiRNA抑制

关键词： fbxw10 肝细胞性肝癌肿瘤发生性别生存

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O-GlcNAc修饰对泛素化相关基因的调控

O-GlcNAc修饰对泛素化相关基因的调控

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作者：周丰天津大学

学位级别：硕士

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和O-GlcNAc修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连... 详细信息

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和O-GlcNAc修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）催化的多步反应，这些酶中有一些能被O-GlcNAc修饰，或在转录水平受O-GlcNAc修饰的蛋白调节。本研究发现了在HEK293T细胞中的蛋白泛素化和O-GlcNAc修饰的联系。通过在HEK293T细胞中转染OGT，使其过表达sOGT、ncOGT，以及加入PUGNAc（OGA的抑制剂）和加入GLcN三种方式来提高细胞中蛋白的O-GlcNAc的修饰水平。在三种提高O-GlcNAc修饰水平的条件下，通过RT2profiler PCR array方法，检测人泛素化途径相关的84个基因转录水平的变化。其中fbxw10蛋白是一种泛素化的靶特定蛋白F-Box蛋白，在以上增加O-GlcNAc修饰的方式中都出现下调表达。根据GlcN对fbxw10基因有负调节作用，在HEK293T细胞中加入GlcN，在不同时间点进行real-timePCR和Western Blot检测，本研究发现在不同时间点mRNA水平和蛋白水平都有明显下调。另外本研究还发现HEK293T细胞中内源的fbxw10被O-GlcNAc修饰，O-GlcNAc修饰可能在多重水平上调节fbxw10。这些发现都说明O-GlcNAc修饰与泛素化相关基因的调节有关，对理解O-GlcNAc和泛素化之间的相互联系起到重要作用。

关键词：蛋白间相互应答泛素化 O-GlcNAc修饰 F-box蛋白 fbxw10 FBXO4 Real-timePCR 阵列分析

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