FBXW10促进ANXA2泛素化介导男性肝癌恶性进展的机制研究

作     者：刘泽宇 

作者单位：中国人民解放军陆军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张雷达

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：FBXW10 ANXA2 S6K1 KRAS 泛素化修饰 肝细胞癌 

摘      要：研究背景和目的肝癌是一种高度侵袭性的原发性恶性肿瘤,是世界范围内第三大癌症死亡原因,患病率居第六位。肝癌主要包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管癌和混合性肝癌三种类型,其中肝细胞癌占肝癌总数的75-85%。研究发现在非生殖系统恶性肿瘤中,男性和女性患者发病率与死亡率具有显著的性别偏移。在肝癌中,男性患者的发病率和死亡率约是女性患者3倍。但男性比女性更易患肝癌的机制至今尚不清楚。早期研究认为男性不良生活习惯的相关因素是导致男性肝癌发病率高的主要原因。然而近年来组学研究发现,男性特异性基因或蛋白升高可能是促进肝癌发生发展的主要因素,但具体分子机制目前尚无报道。泛素化修饰是翻译后修饰(Post Translational Modifications,PTMs)的一种常见类型,在蛋白质降解、激活及稳定中发挥重要作用。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)通过一系列酶促反应发挥其生物学功能,包括泛素激活酶E1启动泛素激活,并将泛素转移到泛素结合酶E2,E2最终与泛素-蛋白E3连接酶结合,催化特定底物的泛素化修饰。FBXW10属于FBXW亚群(富含WD重复域),是E3泛素连接酶复合物中的底物识别蛋白亚基F-box,参与底物识别和蛋白泛素化降解或活化。我们最新研究发现E3泛素连接酶FBXW10在肝癌中异常高表达,且与男性患者预后呈负相关,与女性患者无关。但FBXW10如何促进男性肝癌恶性进展的分子机制尚不清楚。研究方法1.利用蛋白质组学与蛋白质泛素化修饰组学分析FBXW10-Tg(+)雄性与雌性小鼠肝癌组织中泛素化差异蛋白,结合免疫共沉淀(Co-IP)实验明确与FBXW10相互结合的潜在蛋白,通过维恩图交叉筛选出泛素化上调互作蛋白ANXA2(Lys148)、FASN和RPL13A。通过临床预后与CCK-8细胞功能实验,明确ANXA2是否是FBXW10介导男性肝癌发生的关键分子。2.利用体内泛素化实验明确FBXW10介导ANXA2泛素化靶位点及多聚赖氨酸修饰链类型。结合免疫荧光、Transwell和CCK-8实验明确ANXA2及其靶位点对FBXW10介导的肝癌细胞增殖与迁移的作用。3.利用磷酸化修饰组学分析FBXW10-Tg(+)雄性与Wild-type雄性小鼠肝癌组织,明确FBXW10异常高表达时ANXA2发生磷酸化的潜在位点。结合Co-IP、体内泛素化、免疫荧光、Transwell和CCK-8实验明确ANXA2磷酸化位点与功能活性的关系。4.通过查阅文献及GSEA软件富集分析明确与ANXA2显著相关的信号通路,结合Co-IP和Western blot实验明确FBXW10是否通过激活ANXA2,从而上调下游信号通路。5.利用裸鼠肝原位移植肿瘤模型明确抑制ANXA2是否可以逆转FBXW10驱动的雄性肝癌发展和肺转移。6.利用免疫组化染色分析BXW10和ANXA2蛋白在男性和女性患者中的表达情况,通过统计分析明确FBXW10和ANXA2对男性和女性肝癌患者预后的影响。研究结果***2与FBXW10特异性结合,并在Lys148位点发生K63型泛素化修饰,从而提高ANXA2膜定位水平。2.下调ANXA2抑制FBXW10介导的肝癌细胞增殖和迁移(P0.05)。ANXA2Lys148具有促进肝癌细胞增殖和迁移的作用,K148突变后FBXW10无法激活ANXA2促进肝癌细胞增殖及迁移(P0.05)。3.S6K1促进ANXA2 Ser12和Ser26位点磷酸化修饰,从而促进FBXW10结合并泛素化和活化ANXA2。活化的ANXA2可与KRAS结合,上调p-ERK,激活MEK/ERK和EMT通路。4.体内实验证实,敲低ANXA2可显著抑制FBXW10驱动的雄性小鼠肝癌发展和肺转移(P0.05)。5.免疫组化染色分析显示FBXW10和ANXA2在男性肝癌中表达显著相关(P0.05),FBXW10和ANXA2共同高表达提示男性肝细胞癌患者预后不良(P0.05)。研究结论FBXW10与ANXA2在男性HCC组织中高表达,与不良预后正相关。S6K1通过促进FBXW10识别并泛素化ANXA2,激活KRAS和MEK/ERK信号通路,促进男性肝癌恶性进展。