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基于FMDV 2A肽的新城疫病毒共表达系统的构建及验证

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中国兽医科学 2023年第2期53卷 198-206页

作者：王海蓉李泽典任园园陈建余祖华魏颖丁轲陈松彪贾艳艳郁川张春杰何雷洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 洛阳职业技术学院河南洛阳471003

为构建表达双外源基因的重组新城疫病毒(NDV)反向遗传学表达体系,本研究利用口蹄疫病毒(FMDV)2A序列构建同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因的重组NDV(rLS-EGFP-F2A-RFP),并检测双外源蛋白的表达水平。生物... 详细信息

为构建表达双外源基因的重组新城疫病毒(NDV)反向遗传学表达体系,本研究利用口蹄疫病毒(FMDV)2A序列构建同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因的重组NDV(rLS-EGFP-F2A-RFP),并检测双外源蛋白的表达水平。生物学特性检测结果显示,重组病毒保持了亲本La Sota株的鸡胚高滴度生长以及低致病力的遗传特性,生长曲线分析表明,重组病毒具有与亲本毒株相似的生长动力学特性,在细胞培养中能够稳定复制;荧光观察结果表明,EGFP和RFP蛋白在重组病毒感染细胞中均获得表达且具有生物学活性;Western-blot试验结果表明,F2A肽在重组NDV表达系统中发挥了良好的自剪切功能,双外源蛋白均可独立表达。本研究为NDV多联疫苗的研发提供实验依据和技术平台。

关键词：重组新城疫病毒 F2A肽 EGFP RFP 共表达体系

siRNA介导的甘蔗鞭黑粉菌基因沉默方法的建立

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基因组学与应用生物学 2022年第2期41卷 296-304页

作者：吴昊鸣张沛然卢姗仇金凤李茹陈保善广西大学生命科学与技术学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学农学院南宁530004 广西壮族自治区甘蔗生物学重点实验室南宁530004

甘蔗是全世界最重要的糖料作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一个全球性的病害,对甘蔗生产造成巨大危害。RNA干扰技术是一种快速有效的研究基因功能的方法,然而尚没有在甘蔗鞭黑粉菌中利用RNA干扰研究... 详细信息

甘蔗是全世界最重要的糖料作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑穗病是一个全球性的病害,对甘蔗生产造成巨大危害。RNA干扰技术是一种快速有效的研究基因功能的方法,然而尚没有在甘蔗鞭黑粉菌中利用RNA干扰研究基因功能的报道。本研究以荧光蛋白基因EGFP为靶标,构建了表达EGFP的菌株JG35-EGFP和含有EGFP基因回文序列的干扰菌株JG36-EGFP-RNAi,将其进行有性配合,结果显示,EGFP基因表达量及荧光强度均显著下降,表明甘蔗鞭黑粉菌的RNA干扰系统构建成功。我们用此干扰系统对甘蔗鞭黑粉菌的效应物基因g2476的功能进行研究,发现目的基因在单倍体及有性配合形成的菌丝中表达水平均明显下调,但RNA干扰单倍体的有性配合能力并无明显变化。甘蔗鞭黑粉菌中RNA干扰方法的建立为该菌基因功能研究提供了新的工具,并为培育HIGS(Host induced gene silencing)抗病植株奠定了基础。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌 RNA干扰报告基因 EGFP 效应物

鼠伤寒沙门氏菌荧光定位报告菌株的构建及其在猪肺泡巨噬细胞的示踪应用

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华北农学报 2023年第2期38卷 232-238页

作者：肖红何珍田棋黄鑫淼廖卫东黄廷华姚敏长江大学动物科学学院湖北荆州434020

利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用,首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定,获得了具有绿色... 详细信息

利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用,首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定,获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性,命名为Sal-pPpagC-EGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性,通过小鼠感染试验检测EGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响,以分析荧光菌株的生物学特性;应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示,在不同时间点,EGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光,且所带荧光不受抗性选择的影响,可稳定遗传。相同培养条件下,荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外,经过改良寇氏法计算出的LD_(50)与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明EGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后,吞噬溶酶体内可观察到标记菌株,并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外,其他生物学性状没有明显改变。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌 EGFP 电转化生物学特性胞内示踪

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噬菌体展示技术筛选抗EGFP纳米抗体

噬菌体展示技术筛选抗EGFP纳米抗体

作者：周建松云南大学

学位级别：硕士

增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对EGFP的抗体研究更多的还是传统的多... 详细信息

增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)是绿色荧光蛋白(GFP)的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对EGFP的抗体研究更多的还是传统的多克隆及单克隆抗体,不过传统抗体分子量较大,应用中会因此受限,而纳米抗体是目前已知的具有抗原识别活性的最小抗体单位,其有体积小、穿透性强、易改造等传统抗体不具备的优势,因此本文致力于寻找高亲和力抗EGFP纳米抗体并开展相关研究。本研究利用噬菌体展示技术,从羊驼(Vicugna pacos)来源的天然噬菌体库中筛选得到抗EGFP纳米抗体,经测序得知其基因序列后,将其构建到真核表达载体上,并转染到HEK293细胞中共表达,通过免疫共沉淀技术检测抗原EGFP与纳米抗体之间的相互作用。由于从天然噬菌体库中得到的抗EGFP纳米抗体亲和力一般,因此本研究对纳米抗体的互补决定区3(complementarity determining region3,CDR3)进行氨基酸定点突变,以期获得亲和力更高的纳米抗体。主要研究内容如下:1、利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,经镍柱亲和纯化得到EGFP作为噬菌体展示技术中所需抗原;2、采用固相亲和生物淘选的方法筛选得到14个抗EGFP阳性噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附检测(ELISA)发现筛选得到的纳米抗体与牛血清白蛋白(BSA)无交叉反应且特异性较好,因此进一步进行多序列比对分析,得到3种纳米抗体基因序列:VHH1、VHH2和VHH3;3、利用基因工程技术将E1-2、E1-12、A2-9和G2-5四个克隆的抗EGFP纳米抗体分别与flag标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上,EGFP则与myc标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上;然后通过免疫共沉淀技术检测抗原与抗体的相互作用。实验结果显示,两种纳米抗体序列(VHH2和VHH3)的四个实验组(E1-12-(1)、E1-12-(2)、A2-9和G2-5)与抗原EGFP在细胞内有相互作用,但互作能力一般;4、对筛选得到的E1-12纳米抗体的CDR3区进行氨基酸定点突变,结合免疫共沉淀技术,检测到结果中有三个突变体亲和力得到提高,其中突变体E1-12-S104K的亲和力最高,E1-12-S104R和E1-12-S104Q次之。突变体E1-12-S104W、E1-12-S104G、E1-12-S104E的亲和力较E1-12不增反减,突变体E1-12-A99V、E1-12-G100N、E1-12-P103F则失去了与EGFP的亲和力。结果说明CDR3区上的氨基酸对于抗EGFP纳米抗体结合抗原很重要,特别是该区域的热点序列,因此推测可能是由于这些氨基酸参与抗体结合区的结构微调,导致其亲和力变化。

关键词： EGFP 抗EGFP纳米抗体噬菌体展示技术抗体亲和力成熟

Use of electroporation as an option to transform the horn fly, Haematobia irritans： a species recalcitrant to microinjection

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Insect Science 2016年第4期23卷 621-629页

作者： Qiang Xu Felix D. Guerrero Azhahianambi Palavesam Adalberto A. Perez de Leon Department of Biology Abilene Christian University Abilene TX 79699 USA USDA-ARS Knipling-Bushland U.S. Livestock Insects Research Laboratory 2700 Fredericksburg Rd. Kerrville TX 78028 USA USDA-ARS Veterinary Pest Genomics Center Kerrville TX 78028 USA

The horn fly, Haematobia irritans, is a serious pest of cattle in North America. The control of horn flies has primarily relied on insecticides. However, the heavy use of insecticides has led to the development of insecticide resistance in horn flies. Novel methods to control horn flies are greatly needed. Transgenic technology is an effective tool to genetically modify insects and may lead to novel methods of pest control based on genomic approaches. Here we report apiggyBac-mediated transformation of the horn fly via electroporation. Transformation with a DsRed fluorescent marker protein coding region was verified by PCR analysis of individual fly bodies and pupal cases and sequencing of PCR products. However, Southern blot analysis failed to indicate the DsRed gene was integrated into the horn fly genome. Thus, the electroporation protocol may have caused the DsRed gene to be integrated into bacterial symbionts of the horn fly.

关键词： DsRed EGFP electroporation Haematobia irritans horn fly transformation transgenic insect

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高亲和力抗EGFP纳米抗体的筛选与应用

南昌大学学报（理科版） 2021年第1期45卷 34-40页

作者：刘晓芳刘贝周方月黄云祥钟引凤张茹云梁宇芳王丹付金衡南昌大学生命科学学院江西南昌330031 南昌大学中德联合研究院江西南昌330047 江西农业大学江西南昌330045

将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选EGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase... 详细信息

将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选EGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白。四免后抗血清滴度超过1.28×10^(6),获得库容量为1.85×10^(8) cfu的抗EGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与EGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10^(-11)M;纳米抗体4-28与EGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10000~1:25000(浓度100~40 ng·mL^(-1)),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5000~1:20000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-EGFP。

关键词：纳米抗体 EGFP 噬菌体展示 ELISA IP

构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达EGFP基因

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微生物学报 2012年第3期52卷 318-325页

作者：葛菁萍唐晓艳高冬妮宋姗姗鲁珊楼庄伟平文祥微生物黑龙江省高校重点实验室黑龙江大学生命科学学院哈尔滨150080

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(EGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系... 详细信息

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(EGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对EGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的EGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达EGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中EGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。

关键词：重组杆状病毒 T7RNA聚合酶/启动子 EGFP OL细胞鸡胚原代细胞

KGF和EGFP双基因共表达的重组腺病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究

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中国实验血液学杂志 2012年第2期20卷 427-432页

作者：王美华胡锴勋李晓兵军事医学科学院附属307医院病理科北京100071

为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质... 详细信息

为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度。转染至小鼠骨髓MSC中,为胸腺组织修复免疫功能恢复提供前期实验基础。结果表明:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-mKGF重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.6 kb和5.1 kb 2个条带;重组腺病毒载体质粒pAdxsi-mKGF病毒质粒经酶切鉴定得到阳性克隆;测定重组腺病毒Ad-EGFP-mKGF半数组织培养感染量的滴度为1.6×1010 pfu/ml。转染后10 hMSC开始表达荧光,6-8 d达高峰,转染率可达92.3%,28 d仍有表达。结论:pAdxsi-mKGF病毒质粒构建成功并能高效、安全地转染MSC。

关键词： KGF EGFP 重组腺病毒载体 MSC

RNA Guided Genome Editing in Mouse Germ-Line Stem Cells

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Journal of Genetics and Genomics 2014年第7期41卷 409-411页

作者： Xuepeng Wang Yan Yuan Quan Zhou Haifeng Wan Mei Wang Qi Zhou Xiao-Yang Zhao Jiahao Sha State Key Laboratory of Reproductive Biology Institute of ZoologyChinese Academy of Sciences University of Chinese Academy of Sciences State Key Laboratory of Reproductive Medicine Institute of ToxicologyNanjing Medical University

Spermatogonial stem cells （SSCs） reside on the basement membrane of the seminiferous tubules in mammalian testes （Nagano et al., 1998）. After isolation and purification of SSCs from mouse testis, SSCs can be cultured in vitro to derive germ-line stem cells （GSCs） which have the ability of proliferation over 2 years （Kanatsu-Shinohara et al.. 2003;

关键词： EGFP In