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第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛

作者： ZHAO Lichan CHENG Anchun WANG Mingshu CAI Mingsheng YUAN Guiping (1.Research Center of Avian Disease,College of Veterinary Medicine of Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China 2.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province,Ya’an 625014,China 3.Analytical & Testing Center,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610064,China)

A 1344bp gene of Duck Enteritis Virus (dev) homologous to dUTPase,was first discovered by constructing the dev genomic *** analyzed the codon usage of dev dUTPase gene (GenBank accession number DQ486149) by using CAI (Codon Adaptation Index),CHIPS (Codon Heterozygosity in a Protein-coding Sequence) and CUSP (Create a codon usage table) program of EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite).The results showed that the dev dUTPase gene had similar codon usage pattern with avian alpha- and ***-one codons were used in the polypeptide,with a strong bias towards the codons with A and T at the third codon *** of comparison analysis revealed that there are 19 codons showing distinct usage differences between dev dUTPase and ***,16 between dev dUTPase and yeast,15 between dev dUTPase and *** analysis showed high significant differences in dev dUTPase and yeast (r=0.536,P<0.01).

关键词： dev dUTPase codon usage bias EMBOSS

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重组dev gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位

重组DEV gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位

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作者：汤海宽东北农业大学

学位级别：硕士

鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis，DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，dev)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前dev的研究已经进入基因组时代，截至目前至少已克隆出41个完整的dev ORF。本... 详细信息

鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis，DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，dev)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前dev的研究已经进入基因组时代，截至目前至少已克隆出41个完整的dev ORF。本研究以克隆的dev gH与UL24基因为出发点，对dev gn与UL24蛋白的特性进行初步研究。重组dev gH与UL24基因杆状病毒的构建：根据已发表的dev gH与UL24基因序列，设计引物p1／p2、p3／p4与p5／p6并以dev核酸为模板克隆gH(2505bp)与UL24(1230bp)基因。其中将gH基因分为互相重叠的两个片段gH1与gH2，用引物p1／p2扩增gH1基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-gH1;引物p3／p4扩增gH2基因。用XhoⅠ与SfcⅠ双酶切pMD18-T-gH1，sfcⅠ与KpnⅠ双酶切gH2，最后将这两段酶切产物与pBlueBacHis2A连接，成功构建了重组杆状病毒转移载体pBlue-gH。用p5／p6扩增UL24基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-UL24，用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切pMD18-T-UL24，将酶切产物与pBlueBacHis2A连接，构建重组杆状病毒转移载体pBlue-UL24。分别将鉴定为阳性的重组质粒纯化，与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑筛选，获得了纯化的重组杆状病毒。gH蛋白细胞定位：将gH基因扩增产物连接pMD18-T构建克隆载体pMD18-T-gH，并与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别用HindⅢ与EcoRⅠ双酶切，构建重组真核表达载体pcDNA-gH。将纯化的阳性重组质粒用脂质体法转染293细胞，并用该纯化质粒免疫BALB／c鼠以制备抗gH蛋白血清。间接免疫荧光试验表明，实现了dev gH蛋白在体外的瞬时表达，并发现该蛋白定位于细胞外膜。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，gH基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现目的条带，进一步证明了gH蛋白在体外的表达。UL24蛋白细胞定位：根据已发表的UL24基因序列，设计引物p7／p8以dev核酸为模板进行扩增。将扩增后的目的基因亚克隆至pEGFP-C1载体中，构建重组表达载体pEGFP-UL24，将鉴定为阳性的重组质粒纯化并用脂质体法转染293细胞。用荧光显微镜观察pEGFP-UL24在体外表达，且观察UL24蛋白定位于细胞核。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，UL24基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现特异性的条带，进一步证明了UL24蛋白在体外的表达。

关键词： dev gH基因 UL24基因重组杆状病毒细胞定位

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靶向NF-κB1基因RNAi对dev增殖的影响

靶向NF-κB1基因RNAi对DEV增殖的影响

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作者：贺欣薇贵州大学

学位级别：硕士

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,dev)是威胁和危害水禽养殖产业健康发展的重要病原之一,但其致病机理尚未得到完全阐明。NF-κB分子是动物机体NF-κB信号通路关键分子,在动物多种生物学过程中发挥重要作用,与炎症过程和病毒侵染有关,... 详细信息

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,dev)是威胁和危害水禽养殖产业健康发展的重要病原之一,但其致病机理尚未得到完全阐明。NF-κB分子是动物机体NF-κB信号通路关键分子,在动物多种生物学过程中发挥重要作用,与炎症过程和病毒侵染有关,且NF-κB信号通路的关键调控因子有IL-1β等细胞因子,但有关dev感染与NF-κB信号通路的关联性,未见研究报道。为此,本研究采用RNAi技术沉默NF-κB1基因,分析NF-κB1基因对dev增殖影响,以及分析NF-κB信号通路的下游关键调控因子IL-1β的变化,以期为dev致病机理的揭示提供一些基础依据。1.鸭源IL-1β基因RT-PCR检测方法的建立根据GenBank上鸭源IL-1β基因设计特异性引物,进行PCR扩增得到IL-1β基因片段,回收纯化后连接至pMD19-T载体,转化至大肠杆菌并增菌,提取重组质粒进行鉴定,以重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测并进行特异性、重复性和敏感性检验,结果显示:建立的鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法扩增曲线良好,标准曲线方程y=-3.329x+39.731,扩增效率为99.7%,相关系数为1;该荧光定量PCR方法检测的批内重复变异系数小于2%,批间重复变异系数小于3%;该方法的检测灵敏度达1.74×10copies·μL,为普通PCR方法的100倍,熔解曲线无杂峰,说明特异性良好。这些结果表明本研究成功建立了鸭源IL-1β基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。***感染鸭组织器官IL-1β基因转录变化分析选取40d健康鸭60只,随机分为2组即感染组和正常组,感染组肌肉接种dev而正常组注射生理盐水,于处理后第12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h时捕杀实验鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、气管、肌肉、法氏囊、胸腺和胰腺,提取组织DNA和mRNA样本,以实验室前期建立的dev NP基因普通PCR方法进行dev鉴定,以上述RT-PCR方法进行IL-1β1基因的转录水平检测。结果显示:感染组鸭组织器官均检测到dev NP基因正常组均未检出,说明dev感染成功;感染组鸭组织器官IL-1β基因转录水平不同时段上升且高于正常组,其中72h时肺脏、脾脏和肾脏IL-1β转录水平上调幅度最大,达正常组100倍以上。这些结果表明,dev感染能显著上调IL-1β转录水平。3.靶向NF-kB1基因RNAi对dev增殖及主要细胞因子分泌的影响取本实验室前期构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-1,转染DEF细胞进行沉默效果分析并检测重组质粒对细胞增殖的影响;将病毒感染与质粒转染以三种方法处理DEF细胞细胞,即先接毒24h后转染质粒、先转染质粒24h后接毒和同时进行接毒及质粒转染,于处理后第36h、48h、60h和72h时观察转染荧光情况;同时采用RT-PCR方法检测dev-NP基因及IL-1β基因转录水平,ELISA方法检测NF-κB信号通路下游因子IL-1β、myD88、TNFα、IL-6和IL-8分泌情况,结果显示:重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-2干扰效率达78.77%,沉默效果最好;干扰重组质粒对DEF细胞存活的影响不大;在三个处理组中,与dev实验组比较,先接毒后转染组对dev增殖影响差异不显著,而先转染后接毒组和同时接毒转染组均对dev增殖均呈现明显的抑制作用,其中第48h以同时接毒转染组的沉默效果最好,沉默效率达83%,而第72h以先转染后接毒组的沉默效果最好,沉默效率达77%;IL-1β转录水平在dev感染组呈先上升后下降趋势,在RNAi干扰组呈先降低后升高趋势,而在RNAi干扰+dev感染组均低于RNAi干扰组和dev组;在不同处理组中,NF-κB下游因子表达水平在不同时间段呈现出一定的变化,其中IL-1β的表达在先转染后接毒组和同时接毒转染组中变化规律相似,都在干扰重组质粒对照组中36h、48h、60h均低于正常组,在dev对照组于36h、60h、72h高于正常组,在干扰重组质粒+dev组呈现先上升后下降的反复变化。这些结果表明,RNA干扰NF-kB1基因,能抑制dev增殖并影响NF-κB信号调理下游因子的分泌。综上所述,本研究成功建立了鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法;dev感染可导致宿主细胞IL-1β基因转录水平上调;RNA干扰NF-kB1基因,能抑制dev的增殖并影响NF-κB信号通路下游因子的分泌。

关键词： dev NF-κB信号通路 RNA干扰 IL-1β基因增殖

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鸭应对dev感染的主要免疫基因筛选

鸭应对DEV感染的主要免疫基因筛选

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作者：吴良涛贵州大学

学位级别：硕士

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,dev)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),是危害养鸭业健康发展的重要病原之一。目前,国内外学者对dev开展多方面深入研究,取得了诸多进展,但主要集中在病毒的形态结构、基因组学及蛋白质组学等方面... 详细信息

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,dev)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),是危害养鸭业健康发展的重要病原之一。目前,国内外学者对dev开展多方面深入研究,取得了诸多进展,但主要集中在病毒的形态结构、基因组学及蛋白质组学等方面,很少涉及到宿主抗病毒感染的转录组学、蛋白质组学及代谢组学上,致使dev致病机理尚未完全清楚。转录组学是从RNA水平研究某一特定组织或细胞的基因转录情况和转录调控规律,是研究基因组遗传信息与蛋白质生物功能的重要纽带。RNA-Seq作为第二代高通量测序方法,具有单次运行产出序列量大、测序准确性高、测序的通量高、运行成本低、灵敏度高等特点,已广泛应用于疾病发生发展机制研究及相关功能基因筛选。为此,本研究通过RNA-Seq技术对dev感染鸭的脾脏组织转录组进行测序分析,开展鸭抗dev感染的主要免疫基因筛选,以期为阐明dev致病机理和鸭抗病毒机制提供基础资料。选取健康雏鸭30只,随机分为3组(2个试验组和1个对照组),隔离饲养至50 d时腿部肌肉接种不同滴度dev,于接种后66 h、90 h和114 h,捕杀试验鸭,采集脾脏组织,提取组织RNA,通过高通量测序技术进行转录组测序,筛选差异表达基因,GO与KEGG数据库进行分析,荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证,结果如下:当dev接种剂量为病毒原液(100× TCID50)时,鸭脾脏在接种66 h、90 h和114 h时的差异表达基因相应有534、685和580个,主要富集在免疫反应、补体激活、细胞粘附、翻译、抗原肽-MHC Ⅱ类分子复合物加工递呈等生物学过程,以及ECM受体互作、细胞粘附分子、核糖体、吞噬体、肠道免疫网络IgA产生等信号通路。其中与免疫相关的差异表达基因相应有70、64和66个。当dev接种剂量为100倍稀释液(10-2× TCID50)时,鸭脾脏在接种66 h、90 h和114 h时的差异表达基因相应有511、485和531个,主要富集在氧运输、抗原肽-MHC Ⅱ类分子复合物加工递呈、免疫反应、补体激活、细胞粘附等生物学过程,以及ECM受体互作、核糖体、细胞粘附分子、吞噬体、肠道免疫网络IgA产生、细胞因子-细胞因子受体互作等信号通路。其中与免疫相关的差异表达基因相应有54、80和59个。对持续上调或下调的免疫相关差异表达基因进行基因共表达分析,发现上述两种不同接种剂量所激发的主要免疫相关基因相应有47和28个;应用荧光定量PCR对其中9个差异表达基因进行验证,结果显示其相对表达量与RNA-Seq测序结果基本一致。上述研究结果提示,不同滴度dev刺激,可从鸭脾脏组织中获得不同主要免疫相关基因,其中LAMA3基因表达持续上调,高共表达能力值的CD34和CYR61基因持续下调。脾脏组织在dev感染过程中调控复杂的生物学过程、代谢途径及信号通路。差异表达免疫相关基因主要参与免疫反应、补体激活、细胞粘附等生物学过程。这为进一步阐明dev感染机理和机体免疫应答机制提供了基础资料。

关键词： dev 脾脏转录组高通量测序免疫基因

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NF-κB1基因干扰质粒的构建及其对dev增殖的影响

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生物技术 2019年第2期29卷 106-110,160页

作者：贺欣薇郑敏胡安东杨颖周碧君程振涛文明贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 重庆三峡职业学院重庆404155 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵州贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵州贵阳550025

[目的]探究NF-κB对dev增殖是否有影响。[方法]以NF-κB1基因作为靶基因,设计并构建4个不同p GPU6/GFP/Neo shRNA表达载体,通过荧光显微镜法观察转染后细胞荧光密度和RT-PCR检测转染细胞NF-κB1基因转录水平以筛选最佳干扰质粒,分3种不... 详细信息

[目的]探究NF-κB对dev增殖是否有影响。[方法]以NF-κB1基因作为靶基因,设计并构建4个不同p GPU6/GFP/Neo shRNA表达载体,通过荧光显微镜法观察转染后细胞荧光密度和RT-PCR检测转染细胞NF-κB1基因转录水平以筛选最佳干扰质粒,分3种不同组别进行干扰实验后,以荧光定量PCR法检测dev-NP基因表达变化。[结果]所构建的重组质粒p GPU6/GFP/Neo-NF-κB1-2对细胞NF-κB1基因的干扰效率最高,可达78. 77%;除先感染后干扰组对dev增殖影响不大外,先干扰后感染组与同时感染和干扰组均对dev增殖呈现出一定的抑制作用,其中先干扰后感染组在第72 h时的沉默效率最高,可达78%,而同时感染和干扰组于第48 h时的沉默效率最高,可达82%。[结论]RNA干扰下调NF-κB1基因会抑制dev增殖。

关键词： dev NF-κB 构建 RNA干扰增殖

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携带dev-gB基因重组质粒减毒沙门氏菌在鸭免疫器官中的表达动态

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山地农业生物学报 2021年第6期40卷 37-43页

作者：刘妍罕王相金胡安东曾茂芹杨颖温贵兰程振涛文明贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州农业职业学院畜牧水产系贵州清镇551400 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵州贵阳550025

为明确含dev-gB基因重组减毒沙门氏菌在鸭免疫器官中的分布动态,本研究将重组减毒沙门氏菌口服接种鸭(即重组细菌组),同时设立重组质粒组、弱毒疫苗组和空白对照组,于免疫后第7、14、21、28、35、42和49天时,捕杀试验鸭,采集鸭脾脏、胸... 详细信息

为明确含dev-gB基因重组减毒沙门氏菌在鸭免疫器官中的分布动态,本研究将重组减毒沙门氏菌口服接种鸭(即重组细菌组),同时设立重组质粒组、弱毒疫苗组和空白对照组,于免疫后第7、14、21、28、35、42和49天时,捕杀试验鸭,采集鸭脾脏、胸腺、法氏囊和哈德氏腺等免疫器官,采用间接免疫荧光法进行dev-gB抗原检测观察,结果显示:空白对照组鸭免疫器官在7个时间点均未检测到dev-gB抗原信号;免疫后,重组细菌组、弱毒疫苗组和重组质粒组鸭免疫器官均能检测到dev抗原阳性信号,但含dev抗原阳性信号细胞数量从多到少的组别顺序是弱毒疫苗组、重组细菌组和重组质粒组,且重组细菌组与弱毒疫苗组差异不显著(P>0.05);检出含dev抗原阳性信号的免疫器官先后顺序是脾脏、法氏囊、哈德氏腺和胸腺,而含dev抗原阳性信号细胞数量从多到少的免疫器官顺序是脾脏、法氏囊、胸腺和哈德氏腺。由此可见,本研究构建的携带dev-gB基因重组减毒沙门氏菌能在鸭免疫器官中得到良好的表达,为该重组细菌疫苗的临床应用奠定了理论基础。

关键词： dev 重组减毒沙门氏菌鸭表达动态

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CMMI-dev V2.0模型评估方法要点解读

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电子世界 2020年第22期 56-57页

作者：蒲冬梅广州赛宝认证中心服务有限公司

2018年3月8日,CMMI2.0(以下简称2.0模型)正式发布,从2020年10月开始CMMI研究院只接受基于2.0模型的评估申请。所以基于CMMI dev1.3(以下简称1.3模型)的评估必需在2020年9月底前完成。事实上从1.3模型到2.0模型,无论是模型的内容、实践... 详细信息

2018年3月8日,CMMI2.0(以下简称2.0模型)正式发布,从2020年10月开始CMMI研究院只接受基于2.0模型的评估申请。所以基于CMMI dev1.3(以下简称1.3模型)的评估必需在2020年9月底前完成。事实上从1.3模型到2.0模型,无论是模型的内容、实践域的划分还是评估方法都有较大程度的改变,企业在导入2.0模型时或多或少会碰到各种问题,更有甚者可能个别企业因为没有掌握2.0模型版本内容变化的具体要求,导致评估被终止,大量的资源和人力被浪费。基于这种背景,为了提升企业导入2.0模型的效率和成功率,本文在以下的内容会针对企业实施2.0模型来进行改进工作所涉及的主要变化进行阐述,具体包括:项目的准备和抽样、组织绩效的改进报告,ATM的培训、评估类型的选择、评估规划和评估执行。

关键词： CMMI 模型评估 dev 评估方法

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间接ELISA检测鼠抗dev特异性血清IgG和肠道IgA方法的建立

间接ELISA检测鼠抗DEV特异性血清IgG和肠道IgA方法的建立

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第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛

作者：蒋金凤程安春汪铭书路立婷四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川农业大学动物微生态工程研究中心

本文旨在为肠炎病毒(dev)gC基因疫苗体疫免疫和粘膜免疫检测提供稳定的方法。用鼠抗dev血清抗体和肠道IgA抗体作为阳性样本,对建立检测鼠抗dev特异性血清IgG和肠道分泌IgA间接ELISA方法各个条件进行优化。鼠抗dev特异性血清IgG和肠道分... 详细信息

本文旨在为肠炎病毒(dev)gC基因疫苗体疫免疫和粘膜免疫检测提供稳定的方法。用鼠抗dev血清抗体和肠道IgA抗体作为阳性样本,对建立检测鼠抗dev特异性血清IgG和肠道分泌IgA间接ELISA方法各个条件进行优化。鼠抗dev特异性血清IgG和肠道分泌IgA间接ELISA方法的抗原包被浓度分别为0.5μg/ml和1μg/ml,一抗工作浓度分别为1:8和原液,酶标抗体工作浓度为1:5000和1:8000,一抗孵育温度和时间都为37℃1h,酶标抗体孵育温度和时间分别为37℃1h和37℃2h,底物作用时间都为40min,阴阳性临界值分别为0.259和0.297,具有良好的特异性和重复性。本研究建立的两种间接ELISA方法能为dev gC基因疫苗的体液免疫和粘膜免疫检测提供稳定的检测方法。

关键词：间接ELISA法 dev 抗体

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瑜伽是我的态度—印度籍教练dev

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城色 2008年第9期 158-161页

作者： Vera

从瑜伽之都到中国,从瑜伽少年到教练,他一路走来,用肢体诠释瑜伽,用心灵感悟瑜伽。在他眼里,瑜伽已经成为一种执著,一种信念,一种行走于世界的方式和态度。

关键词： dev 心灵感悟希瓦瑜伽师过人之处中信广场就这样电视节目静修新疆人

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物装公司通过CMMI-dev V2.0认证 001

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石油管道报

作者：陈敏

本报讯（通讯员陈敏）12月23日，物装公司成功通过CMMI-dev V2.0 3级认证（能力成熟度模型集成2.0版本标准3级认证）。物装公司在软件设计、开发、项目管理及为用户提供高质量产品方面已具备国际专业水平，符合国际软件开发技术和管... 详细信息

本报讯（通讯员陈敏）12月23日，物装公司成功通过CMMI-dev V2.0 3级认证（能力成熟度模型集成2.0版本标准3级认证）。物装公司在软件设计、开发、项目管理及为用户提供高质量产品方面已具备国际专业水平，符合国际软件开发技术和管理要求。CMMI由美国卡耐基梅隆大学软件

关键词： CMMI-dev dev

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