重组DEV gH与UL24基因杆状病毒构建及gH与UL24蛋白细胞定位

作     者：汤海宽 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王君伟

授予年度：2007年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：DEV gH基因 UL24基因 重组杆状病毒 细胞定位 

摘      要：鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis，DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前DEV的研究已经进入基因组时代，截至目前至少已克隆出41个完整的DEV ORF。本研究以克隆的DEV gH与UL24基因为出发点，对DEV gn与UL24蛋白的特性进行初步研究。 重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建：根据已发表的DEV gH与UL24基因序列，设计引物p1／p2、p3／p4与p5／p6并以DEV核酸为模板克隆gH(2505bp)与UL24(1230bp)基因。其中将gH基因分为互相重叠的两个片段gH1与gH2，用引物p1／p2扩增gH1基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-gH1;引物p3／p4扩增gH2基因。用XhoⅠ与SfcⅠ双酶切pMD18-T-gH1，sfcⅠ与KpnⅠ双酶切gH2，最后将这两段酶切产物与pBlueBacHis2A连接，成功构建了重组杆状病毒转移载体pBlue-gH。用p5／p6扩增UL24基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-UL24，用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切pMD18-T-UL24，将酶切产物与pBlueBacHis2A连接，构建重组杆状病毒转移载体pBlue-UL24。分别将鉴定为阳性的重组质粒纯化，与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑筛选，获得了纯化的重组杆状病毒。 gH蛋白细胞定位：将gH基因扩增产物连接pMD18-T构建克隆载体pMD18-T-gH，并与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别用HindⅢ与EcoRⅠ双酶切，构建重组真核表达载体pcDNA-gH。将纯化的阳性重组质粒用脂质体法转染293细胞，并用该纯化质粒免疫BALB／c鼠以制备抗gH蛋白血清。间接免疫荧光试验表明，实现了DEV gH蛋白在体外的瞬时表达，并发现该蛋白定位于细胞外膜。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，gH基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现目的条带，进一步证明了gH蛋白在体外的表达。 UL24蛋白细胞定位：根据已发表的UL24基因序列，设计引物p7／p8以DEV核酸为模板进行扩增。将扩增后的目的基因亚克隆至pEGFP-C1载体中，构建重组表达载体pEGFP-UL24，将鉴定为阳性的重组质粒纯化并用脂质体法转染293细胞。用荧光显微镜观察pEGFP-UL24在体外表达，且观察UL24蛋白定位于细胞核。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA，UL24基因特异性引物进行RT-PCR检测，结果出现特异性的条带，进一步证明了UL24蛋白在体外的表达。