检索结果-南通市图书馆

作者：黄铖铖苏州大学

学位级别：硕士

目的: 研究氚水染毒和Coγ射线照射后,小鼠基因组DNA甲基化模式和脏器组织甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1, dnmt1)表达的改变,并筛选电离辐射损伤的特异性甲基化基因,从表观遗传学角度阐述辐射损伤的机制,为辐射损伤防护提供新... 详细信息

目的: 研究氚水染毒和Coγ射线照射后,小鼠基因组DNA甲基化模式和脏器组织甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1, dnmt1)表达的改变,并筛选电离辐射损伤的特异性甲基化基因,从表观遗传学角度阐述辐射损伤的机制,为辐射损伤防护提供新的靶点。方法: 1. SPF级C57BL/6J雄性小鼠经氚水染毒(1.85×10 Bq/g,5.55×10 Bq/g,16.65×10 Bq/g)或Coγ射线(1Gy/min,4Gy)单次全身照射后,计数外周血白细胞(white blood cell, WBC)和骨髓嗜多染红细胞微核率(micronucleus rate of polychromatic crythrocytes, fMNPCE),分析血生化、肝脏超氧化物岐化酶活性(superoxide dismutase, SOD)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,应用甲基化DNA免疫沉淀-芯片杂交技术(Methylated DNA Immunoprecipitation-chip, MeDIP-chip)分析小鼠肝组织基因组甲基化模式,采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(免疫组化SP法)和western blot蛋白印记法检测小鼠各组织dnmt1表达。采用image-pro plus6.0软件,对免疫组化的图片读取每高倍视野的累积光密度值(integrated opticaldensity, IOD),以反映蛋白表达总量。 2.对数生长期的大鼠肝细胞(BRL细胞)经Coγ射线(1Gy/min,4Gy)照射后,采用流式细胞计数仪荧光激活细胞分类术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)进行细胞周期分析,Western blot蛋白印记法检测BRL细胞各时间点dnmt1和P53蛋白表达。结果: 1. fMNPCE和WBC (1)随着氚水初始注入浓度的增加,累积剂量增大,各剂量组中的骨髓fMNPCE相应增大,均有显著的统计学差异(P10d时,白细胞总数有所回升,到28d时已恢复,与对照组相比却无显著差异(P>0.05)。 (3) 4Gy60Co-γ射线照射组中,小鼠的外周血WBC总数明显降低(P1)在中、高剂量组中,谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)均在注射氚水后6d、10d显著升高(P1)对照组3922个基因的启动子(promoter)区CpG存在甲基化现象,而在中、高剂量组和照射组中分别为4202、4950、4560个。 (2)在中剂量组中,1031个基因的promoter区CpG岛发生了新的甲基化,746个基因发生了去甲基化。在高剂量组中,发生新甲基化的基因为1550个,发生去甲基化的为518个。而在照射组中,1300个基因的promoter区CpG岛发生了新的甲基化,660个基因发生去甲基化。其中发生甲基化最多的为chr11,发生去甲基化最多的为chr2。 (3)提高筛选标准,通过筛选,在中剂量组发生明显甲基化的基因为Aebp2、Sema3f、Pcdh8、Itpripl2、dnmt3a、Nefl、Fbll1、Snrpe、Lemd1、Hoxc10、Dbf4、Slc25a40,而明显去甲基化的基因为Rest、Eif1a、Kcna7。在高剂量组中,发生明显甲基化的基因为Limk1、Trim71、Stac2、Inhbb、1110034A24Rik、Rcc2、Ccdc102a、Fbxl3、Rshl2b、Cdyl2,而明显去甲基化的基因为Rest

关键词：电离辐射 DNA甲基化 dnmt1

赭曲霉毒素A诱导猪肾细胞毒性作用的表观遗传机制研究

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赭曲霉毒素A诱导猪肾细胞毒性作用的表观遗传机制研究

作者：周亚娇南京农业大学

学位级别：硕士

赭曲霉毒素A(OTA)作为一种天然的污染物,存在于发霉的食物和饲料中,严重威胁到人类和动物的健康。研究表明,OTA能够引起肾毒性,肝毒性,神经毒性,免疫毒性,遗传毒性,致畸性和致癌性等多种毒性作用,其中肾毒性最为突出,影响动物和人类的... 详细信息

赭曲霉毒素A(OTA)作为一种天然的污染物,存在于发霉的食物和饲料中,严重威胁到人类和动物的健康。研究表明,OTA能够引起肾毒性,肝毒性,神经毒性,免疫毒性,遗传毒性,致畸性和致癌性等多种毒性作用,其中肾毒性最为突出,影响动物和人类的健康。OTA的毒性机制主要包括氧化应激,抑制蛋白质合成,干扰免疫功能调节和能量代谢等。许多研究认为氧化应激可能是OTA诱导细胞毒性和凋亡的重要机制之一。据报道,氧化应激可通过改变基因的甲基化或乙酰化来诱导表观遗传修饰的变化。此外,毒素能够诱导表观遗传修饰的变化,有研究发现玉米赤霉烯酮通过影响表观遗传修饰而降低了卵子发育能力。然而,表观遗传是否涉及OTA诱导的PK15细胞毒性迄今尚未阐明。本研究以PK15细胞系作为体外细胞模型,旨在研究表观遗传机制在OTA诱导的细胞毒性作用中所起的作用,为OTA毒性的潜在机制提供一个新的解释。实验一:OTA诱导猪肾细胞毒性及对表观遗传相关酶的影响OTA能够通过氧化应激机制诱导PK15毒性和细胞凋亡,同时氧化应激可诱导表观遗传修饰的变化。然而,表观遗传酶修饰是否参与OTA诱导的细胞毒性和细胞凋亡尚未见报道。因此,本研究的目的是验证OTA诱导的PK15毒性和细胞凋亡,并研究表观遗传酶在OTA诱导的PK15细胞毒性和凋亡中的潜在作用。结果表明,在12小时和24小时,4μg/mL OTA能够诱导细胞毒性和细胞凋亡的产生,降低PK15细胞的活力,增加LDH释放,增加染核形态的变化,Bcl-2/Bax mRNA 比率和凋亡细胞细胞数也上升。同时,OTA处理上调了细胞的ROS水平并下调了细胞内GSH水平。另外,2.0-8.0μg/mL的OTA处理PK15细胞24小时,OTA以剂量依赖性的方式诱导细胞毒性和细胞凋亡的产生,降低了细胞活力并增加LDH释放,增加染核形态的变化和凋亡细胞数量。同时,不同的OTA浓度和不同的OTA作用时间均可以激活表观遗传学相关酶DNA甲基转移酶1(dnmt1)和组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1),使这两种酶的表达呈剂量依赖型和时间依赖型增加。同时,我们观察到高浓度的OTA增加了 dnmt1和dnmt3a表达,OTA对dnmt1表达的影响大于dnmt3a表达。总之,试验结果表明:OTA能够诱导PK15细胞的毒性并且上调及表观遗传相关酶dnmt1和HDAC1。实验二:表观遗传酶在OTA诱导的猪肾细胞毒性和SOCS3过甲基化中的作用研究实验一研究表明,OTA在诱导PK15细胞的毒性和凋亡的同时上调了dnmt1和HDAC1的表达。然而,迄今为止还没有关于表观遗传具体机制在OTA诱导的肾毒性中所起作用的报道。本研究旨在证明表观遗传相关酶在OTA诱导的肾毒性中发挥关键作用并探讨其机制。试验证明,添加dnmt1抑制剂(5-Aza-2dc)或HDAC1抑制剂(LBH589)能够分别抑制OTA诱导的dnmt1或HDAC1表达的上调。同时,添加5-Aza-2dc能够降低GSH水平并上调ROS水平。此外,抑制dnmt1后逆转了 OTA诱导的细胞活力的降低,LDH的产生以及细胞凋亡的增加。而抑制HDAC1后,细胞活力水平和GSH水平并没有显著变化,但是,细胞的LDH水平,ROS水平和细胞凋亡水平都有显著下降。总之,试验结果表明dnmt1和HDAC1在OTA诱导的细胞毒性和细胞凋亡中起关键调节作用。另一方面,OTA诱导SOCS3启动子甲基化并增加SOCS3 mRNA和蛋白水平的表达。而dnmt1抑制剂抑制SOCS3启动子甲基化并促进SOCS3表达的增加。这些结果表明,OTA通过dnmt1介导的SOCS3启动子甲基化来改变PK15细胞中的SOCS3表达,这可能使OTA是诱导PK15细胞毒性和细胞凋亡产生的一个原因,这为OTA毒性的潜在机制提供了新解释。

关键词：赭曲霉毒素A PK15细胞 dnmt1 HDAC1 SOCS3

微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞DNA甲基化影响的体内实验研究

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微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞DNA甲基化影响的体内实验研究

作者：何灏逾广西医科大学

学位级别：硕士

目的：研究微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MCLR)短期重复暴露对小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, dnmts)活性、蛋白及mRNA表达的影响,探讨MCLR诱导的肝毒性与DNA甲基化之间的关系。方法：80只健... 详细信息

目的：研究微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MCLR)短期重复暴露对小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, dnmts)活性、蛋白及mRNA表达的影响,探讨MCLR诱导的肝毒性与DNA甲基化之间的关系。方法：80只健康昆明小鼠,随机分为2批,每批4组,每组10只,即对照组(含0.02%二甲基亚砜的生理盐水0.005ml/g)、MCLR低(5μg/kg)、中(10μg/kg)、高(20μg/kg)剂量组,每天1次称量体重并经腹腔注射染毒,两批分别染毒10天和20天。第11天和第21天处理小鼠,采血后称量肝脏重量,计算体重增长率及肝脏脏器系数;分离血清后,用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase, ALT).谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase, AST).碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase, ALP).总蛋白、白蛋白及球蛋白的水平;取肝组织进行光镜下的病理检查;提取并水解肝细胞DNA,用高效液相色谱法对DNA总体甲基化水平进行测定;提取肝细胞核蛋白,用dnmts酶活性测定试剂盒对DNA甲基转移酶活性进行测定;提取肝细胞总RNA,逆转录成cDNA,用实时荧光定量PCR法对dnmt1、dnmt3a、dnmt3b的mRNA表达进行测定;提取肝细胞蛋白,用Western Blot法测定dnmt1的蛋白表达量。结果： 1.染毒10天和20天后,中、高剂量组体重增长率与对照组比较,均明显降低(P10天低剂量组在ALT、AST、ALP水平上无明显变化(P>0.05)。染毒10天和20天后中、高剂量组血清ALT水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P10天高剂量组,染毒20天低、中、高剂量组AST水平均高于对照组(P10天和20天中、高剂量组ALP水平均高于对照组(P10天后,高剂量组总蛋白、白蛋白水平低于对照组(P10天低剂量组未出现明显病理改变,高剂量组肝细胞出现肿胀,以及少量点状坏死,染毒20天后低剂量组细胞出现肿胀,中剂量组不仅细胞肿胀明显,且汇管区炎性细胞增多,枯否细胞肥大增生,高剂量组中双核细胞增多,并出现坏死灶。 4.染毒10天后,各剂量组DNA总体甲基化水平未出现明显变化。染毒20天中、高剂量组DNA总体甲基化水平为(2.26±0.60)%和(2.16±0.51)%,均低于对照组的(3.31±0.86)%,差异均有统计学意义(P10天或20天后,各剂量组的dnmts酶活性水平与对照组相比均有所上升,差异具有统计学意义(P10天高剂量组dnmt1、dnmt3a及dnmt3b的mRNA表达水平均下调(Pdnmt1、dnmt3a及dnmt3b的mRNA表达水平与对照组比较均下降(Pdnmt1、dnmt3a及dnmt3b的mRNA表达水平分别降至对照组的38.3%、59.9%、21.5%,差异具有统计学意义(P10天后,高剂量组dnmt1蛋白表达水平与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义(Pdnmt1蛋白表达水平有降低的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。 8.血清AST、ALP水平与肝细胞DNA总体甲基化水平呈负相关关系(rAST=-0.29, P1;rALP=-0.40, P1),血清ALT水平与DNA总体甲基化水平之间未见明显相关关系(γ=-0.19,P=0.10)。肝细胞dnmt1、 dnmt3a、dnmt3b mRNA表达与DNA总体甲基化水平呈正相关关系(rdnmtI=47, P1;rdnmt3a=0.37, P1;rdnmt3b=0.36, P1. MCLR短期重复暴露可致小鼠肝脏结构和功能损伤,表现为血清ALT、 AST和ALP水平升高,血清总蛋白、白蛋白水平降低,病理检查发现染毒后肝细胞出现肿胀,并出现坏死灶。 2. MCLR可抑制小鼠肝细胞dnmt1、dnmt3a和dnmt3b的mRNA表达,抑制dnmt1的蛋白表达,降低DNA总体甲基化水平。 3. MCLR引起的肝损伤可能与甲基化异常有关,DNA总体甲基化水平的降低可能与dnmt1、dnmt3a

关键词：微囊藻毒素-LR 甲基化 DNA甲基转移酶 dnmt1 dnmt3a dnmt3b 肝毒性

microRNA-148a与DNA甲基转移酶1对肝癌细胞增殖的影响

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microRNA-148a与DNA甲基转移酶1对肝癌细胞增殖的影响

作者：龙潇冉安徽医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌主要包括肝细胞癌、胆管细胞型肝癌和肝血管瘤。作为死亡率第三的癌症，肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的85-90%，是世界范围内第五大常见癌瘤。近来研究表明，microRNA的异常调节是人类癌症发展中出现的普遍特征。MicroRNA（mi... 详细信息

原发性肝癌主要包括肝细胞癌、胆管细胞型肝癌和肝血管瘤。作为死亡率第三的癌症，肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的85-90%，是世界范围内第五大常见癌瘤。近来研究表明，microRNA的异常调节是人类癌症发展中出现的普遍特征。MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码小分子RNA，其生物学功能为负性调控其靶基因表达。MiR-148/152家族成员miR-148a的抑癌基因样作用及其表达下调已在多种肿瘤中被相继发现，但是，其在肝癌中的下调及作用机制尚不清楚。本文探讨了肝癌中miR-148a的表观遗传学调节及其对肝癌细胞的影响。实验采用一步法实时定量PCR检测人源肝癌细胞系HepG2， SMMC-7721和HCCLM3及正常肝组织细胞系L02中miR-148a的表达情况，通过甲基化特异性PCR（MSP）检测各细胞系中miR-148a启动子区的甲基化水平，通过荧光素酶报告基因系统实验、RT-PCR和Western Blot检测dnmt1的表达水平的差异与变化，通过脂质体LipofectamineTM2000转染dnmt1siRNA至HepG2细胞系中以沉默dnmt1表达，转染miR-148a mimics（模拟物）至HepG2细胞系中后，利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法以及流式细胞术技术观察miR-148a过表达对HepG2增殖、凋亡与周期的影响。应用生物信息方法发现miR-148a潜在靶向dnmt1。结果发现，由于其启动子区CpG岛的异常超甲基化，miR-148a在肝癌细胞系中表现甲基化控制的表达沉默，且其表达可被甲基化抑制剂5-aza-dC呈剂量依赖性恢复。同时，维持甲基化水平的甲基转移酶dnmt1表达水平在肝癌细胞系中异常上调，且其过表达与miR-148a启动子区高甲基化水平密切相关。另一方面，dnmt1作为miR-148a靶蛋白，其表达水平可被miR-148a过表达抑制，提示在肝癌细胞系中dnmt1-miR-148a负性调节回路的存在。实验还发现miR-148a过表达可以通过对肝癌细胞周期的影响而明显抑制肝癌细胞的增殖。以上研究表明，肝癌细胞系中存在dnmt1-miR-148a负性调节回路，且miR-148a发挥抑癌基因样作用，这为相关表观遗传学行为在肝癌诊治中的应用奠定了基础。

关键词：肝细胞癌 miR-148a DNA 甲基化 dnmt1

重楼皂苷Ⅰ以及联合恩杂鲁胺抑制去势抵抗性前列腺癌细胞生长的机制研究

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重楼皂苷Ⅰ以及联合恩杂鲁胺抑制去势抵抗性前列腺癌细胞生长的机...

作者：邹佩良广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:1.体外细胞实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长的抑制作用及分子机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对PC3与DU145细胞生长的抑制增强作用及分子机制。2.体内动物实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺... 详细信息

目的:1.体外细胞实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长的抑制作用及分子机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对PC3与DU145细胞生长的抑制增强作用及分子机制。2.体内动物实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌DU145裸鼠移植瘤的抑制作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解重楼皂苷I体内抗前列腺癌机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对DU145裸鼠移植瘤的抑制增强作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解联合给药在体内抗前列腺癌的协同作用机制。方法:第一部分:***法(四甲基偶氮唑盐比色法)观察PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3和DU145细胞的生长是否具有抑制作用及时间与剂量依赖关系;沉默LncRNA HOTAIR对PC3和DU145细胞的生长是否有抑制作用;过表达HOTAIR、EZH2、dnmt1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI对PC3和DU145细胞周期的影响。3.细胞迁移实验(划痕实验)检测PPI对PC3和DU145细胞迁移能力的影响。4.细胞侵袭实验(Transwell侵袭实验)检测PPI对PC3和DU145细胞侵袭能力的影响。***-blot检测不同剂量PPI、转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、EZH2、dnmt1过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2、dnmt1蛋白表达的影响。***-Time-PCR检测PPI对PC3和DU145细胞的HOTAIR表达水平的影响。7.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI以及转染HOTAIR过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2基因启动子活性的影响。8.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测;观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)对肿瘤生长抑制的效果,及对HOTAIR、EZH2、dnmt1表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制作用。第二部分:***法观察PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的抑制效果并分析是否具有协同作用;过表达MUC1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞周期的影响。***-blot分别检测PPI,PPI联合恩杂鲁胺,转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、P65、P50、MUC1过表达质粒对PC3和DU145细胞的P65、P50、MUC1蛋白表达水平的影响。***-Time-PCR检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞HOTAIR、MUC1 mRNA的表达水平的影响;转染P65及MUC1过表达质粒后对细胞HOTAIR表达水平的影响。5.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的MUC1基因启动子活性的影响;转染HOTAIR过表达质粒后对细胞的MUC1基因启动子活性的影响。6.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组、恩杂鲁胺组、重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测,观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)对肿瘤生长抑制的效果,及对NF-ΚB、MUC1和LncRNA HOTAIR表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I联合恩杂鲁胺治疗对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制具有协同作用。结果:第一部分:***法检测细胞活力实验结果:(1)PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性及时间依赖性(Pdnmt1可逆转PPI对PC3与DU145细胞生长的抑制作用。2.流式细胞术检测细胞周期结果:(1)与对照组比较,PPI可诱导PC3与DU145细胞周期阻滞于S期(P1)与对照组比较,PPI可明显抑制PC3与DU145细胞的迁移能力和侵袭能力(P145细胞蛋白表达及Real-Time-PCR检测细胞LncRNA HOTAIR的表达结果:(1)不同剂量PPI处理PC3与DU145细胞后,细胞内EZH2及dnmt1蛋白的表达都呈

关键词：前列腺癌重楼皂苷Ⅰ 恩杂鲁胺 HOTAIR EZH2 dnmt1 NF-κB/P65 MUC1

基于DNA甲基转移酶的巴氏新小绥螨温度耐受性研究

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基于DNA甲基转移酶的巴氏新小绥螨温度耐受性研究

作者：范文惠西南大学

学位级别：硕士

21世纪以来,生物防治在农业系统发挥着越来重要的作用,巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri因其发育历期短,捕食种类多,种群繁殖力强和扩散能力强等优点,成为一类极具应用前景、可用来防治害螨和小型农业吸汁性害虫的重要生防因子。随着全... 详细信息

21世纪以来,生物防治在农业系统发挥着越来重要的作用,巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri因其发育历期短,捕食种类多,种群繁殖力强和扩散能力强等优点,成为一类极具应用前景、可用来防治害螨和小型农业吸汁性害虫的重要生防因子。随着全球气候的变暖,螨类作为一种变温动物,对温度极其敏感,因此高温也成为制约捕食螨在农业生态系统中持续控制害螨、发挥其生物防治效能的非生物因素。为了提升巴氏新小绥螨***在田间的生物效能,本课题组通过高温锻炼驯化筛选出明显具有温度可塑性和适应性的巴氏新小绥螨***耐高温品系,已有的研究表明其对高温胁迫的承受能力显著增强。本研究着眼于巴氏新小绥螨***生态适应性机制,从表观遗传学的角度研究高温胁迫处理下,两种温度品系雌成螨及各世代之间的DNA甲基化水平差异;在此基础上筛选克隆了Nb dnmt1基因,并对其m RNA表达模式进行分析,最后采用RNAi技术对该基因的温度耐受性功能进行了验证。本研究所获得的主要研究结果如下:1.42°C高温胁迫处理巴氏新小绥螨***两种温度品系雌成螨,测定其全基因组甲基化水平。结果显示,四个处理时间节点,耐高温品系的全基因组甲基化水平均高于常温品系。在处理1 h时,两种温度品系雌成螨的全基因组甲基化水平便达到最大值,分别为0.065%和0.213%。但随着处理时间的增加,两种品系雌成螨的全基因组甲基化水平均有所降低,且两种温度品系在处理3h时全基因组甲基化水平均有小幅度的上升。另外不同世代的雌成螨全基因组甲基化水平随着世代的延长而呈现降低趋势,在F10代达到最低。表明巴氏新小绥螨***对高温的耐受性可能与DNA甲基化变化密切相关。2.利用分子生物学实验克隆获得了1条Nb dnmt1基因c DNA序列,结果表明,Nb dnmt1编码的氨基酸个数为458;系统发育分析表明克隆得到的Nb dnmt1与同一目的螨虫并于同一进化枝上,本研究克隆得到的dnmt1基因与西方静走螨的dnmt1基因亲缘关系最近。利用qPCR技术,对Nb dnmt1基因在不同发育阶段的mRNA表达进行分析,结果表明两种温度品系dnmt1基因均在雌成螨期表达量最高,且均呈现随生长发育而逐渐上调表达的趋势,dnmt1基因可能参与巴氏新小绥螨***生长发育以及雌性的生殖发育调控;对高温胁迫下巴氏新小绥螨*** dnmt1基因表达模式解析结果表明两种温度品系的dnmt1基因均能被高温诱导表达,但是品系间的表达模式因胁迫温度和时间的不同而有所差异:42°C高温胁迫可以显著诱导dnmt1基因的表达,尤其是在耐高温品系中,耐高温品系对极端高温响应更为敏感。38°C高温胁迫可以迅速诱导常温品系dnmt1基因的表达,不同时间节点的表达量均高于高温品系。35°C中等高温环境下常温品系dnmt1基因的表达与38°C高温环境表达趋势相似,说明35°C中等高温环境和38°C高温环境均可以对常温品系形成胁迫。另一方面,42°C高温胁迫处理Nb dnmt1基因的表达趋势与相同温度下测定的DNA甲基化水平趋势基本一致,这也说明dnmt1基因表达量变化是导致巴氏新小绥螨*** DNA甲基化水平变化的机制之一。3.通过给巴氏新小绥螨***饲喂dnmt1基因的dsRNA,对两种温度品系dnmt1基因均进行了有效沉默,与饲喂dsGFP相比,沉默效率分别为38%和52%。干扰后发现巴氏新小绥螨***两种温度品系对高温耐受力均下降,表现为高温胁迫下死亡率显著升高,热击倒时间缩短,进一步说明了dnmt1基因在巴氏新小绥螨***高温耐受性方面扮演着重要角色。综上所述,本研究论文丰富了巴氏新小绥螨***温度耐受性与表观遗传机制的理论研究内容,为提高巴氏新小绥螨***在田间持续控制害虫害螨效能奠定基础。

关键词：巴氏新小绥螨高温耐受性 DNA甲基化 dnmt1

YY1基因对水牛植入前胚胎DNA甲基化影响的初步研究

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YY1基因对水牛植入前胚胎DNA甲基化影响的初步研究

作者：龚云广西大学

学位级别：硕士

阴阳因子1(YY1)是一种广泛存在于生物体中并在进化上高度保守的转录因子,它可以作为基因表达过程中的激活因子和抑制因子参与许多基因的转录调控。为了解YY1基因在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对DNA甲基化的影响和调控作用,本研究克... 详细信息

阴阳因子1(YY1)是一种广泛存在于生物体中并在进化上高度保守的转录因子,它可以作为基因表达过程中的激活因子和抑制因子参与许多基因的转录调控。为了解YY1基因在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对DNA甲基化的影响和调控作用,本研究克隆了水牛YY1基因编码序列,构建了其真核表达载体;筛选抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段,同时探讨了YY1基因过表达对水牛胚胎早期发育及DNA甲基化的影响。 1.水牛YYl基因CDS全长序列克隆及其真核表达载体构建。以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR和降落PCR的方法,扩增水牛YY1基因CDS全长序列。将目的片段连接到pEGFP-N1载体中构建真核表达载体,然后转染293T细胞和水牛成纤维细胞(BFF),通过荧光观察和qRT-PCR方法检测YY1基因表达情况。结果显示,克隆得到的水牛YY1基因CDS全长序列为1248bp,与牛、人、小鼠、大鼠及鸡的同源性达到90%以上。重组质粒pYY1-EGFP-N1可在293T细胞和水牛成纤维细胞中表达;在水牛体细胞水平上,YY1基因表达可促进dnmt1基因的表达。 2.水牛YY1基因表达shRNA干扰片段的筛选。以黄牛YY1基因编码区序列为模板,设计并合成2条shRNA片段,构建其慢病毒表达载体pSicoR-GFP-YY1shRNA1/2。将构建的过表达水牛YY1基因真核表达载体与shRNA表达载体分别以1：1和1：6的比例进行共转染,以pSicoR-GFP和pSicoR-GFP-1864质粒作为空白和阴性对照。采用qRT-PCR和Western-blot方法检测shRNAs的抑制效率。结果发现,设计合成的2条shRNA序列对水牛YY1基因表达均有抑制效果;定量结果显示,pSicoR-GFP-YY1shRNA2(93.64%)的抑制效果显著高于shRNA1(53.77%)。 ***1基因过表达对水牛胚胎发育及DNA甲基化的影响。采用线性化处理的质粒,对体外受精8-10h后的水牛受精卵进行卵胞质注射。分析质粒注射浓度、不同外源DNA质粒对水牛胚胎发育及外源基因表达状况的影响;同时采用qRT-PCR方法分析YY1基因过表达对植入前胚胎发育及dnmt1基因表达的影响。结果发现,受精卵胞质注射25μg/mL pYY1-EGFP-N1质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P>0.05),并取得较高表达EGFP的囊胚比例(33.3%),显著高于其他注射浓度(5,15,50μg/mL)(P1、pYY1-EGFP-N1)对囊胚外源基因表达率影响不显著(P>0.05),注射pYY1-EGFP-N1质粒组的囊胚发育率与未注射组相比差异不显著(P>0.05);YY1和dnmt1基因在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势,随着胚胎的发育,YY1基因的表达逐渐增高,囊胚期达到最高,相反,dnmt1基因在桑葚胚前表达较高,囊胚期表达最低;YY1基因过表达在胚胎水平上会增加dnmt1基因表达,提高水牛胚胎DNA甲基化水平。结论：克隆得到的水牛YY1基因CDS全长序列在生物进化上具有高度保守性;构建的pEGFP-N1-YY1重组质粒可以转染水牛体细胞,YY1基因过表达在体细胞水平上会促进dnmt1基因的表达;筛选得到的2条shRNA干扰序列均能有效抑制水牛YY1基因的表达;水牛植入前胚胎YY1和dnmt1基因的表达模式呈相反的趋势,YY1基因过表达使水牛胚胎dnmt1基因的表达量增高,提高胚胎DNA甲基化水平。

关键词：水牛YY1基因 DNA甲基化 RNA干扰 dnmt1

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组蛋白修饰在胃癌发生发展中的作用

组蛋白修饰在胃癌发生发展中的作用

作者：高福利南京大学

学位级别：硕士

第一部分：H3K27me3和EZH2在胃癌发生发展中的作用及相关性目的：研究H3K27me3和EZH2在胃癌发生发展中的作用和临床意义及两者的相关性。方法：免疫组化方法检测153例组织标本中H3K27me3和EZH2的表达,包括20例正常胃粘膜组织,21例肠上... 详细信息

第一部分：H3K27me3和EZH2在胃癌发生发展中的作用及相关性目的：研究H3K27me3和EZH2在胃癌发生发展中的作用和临床意义及两者的相关性。方法：免疫组化方法检测153例组织标本中H3K27me3和EZH2的表达,包括20例正常胃粘膜组织,21例肠上皮化生,24例异型增生,23例早期胃癌和65例中晚期胃癌;Western-Blot方法检测胃癌细胞SGC7901、BGC823、AGS和正常胃粘膜上皮细胞GES-1中H3K27me3和EZH2的表达。结果：1、H3K27me3在正常组织、肠上皮化生、异型增生、早期胃癌和中晚期胃癌中高表达率分别为10%、19%、29.2%、39.1%和53.8%,H3K27me3在癌前病变和早期胃癌中未发现与年龄、病变部位、HP、肿瘤标记物等有关,但在中晚期胃癌中发现与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、临床分期、TNM分期有关(P1相比,H3K27me3和EZH2在胃癌细胞SGC790、BGC823、AGS中高表达。结论：H3K27me3和EZH2在胃癌的发生、发展中起着重要作用,其高表达可能是胃癌患者重要的预后因子。第二部分：dnmt1、EZH2和HDAC1在胃癌中的表达及相互作用目的：研究胃癌细胞和组织中dnmt1、EZH2和HDAC1的表达及三者互相作用。方法：实时荧光定量PCR (Realtime-PCR)和Western-Blot检测MKN28、 SGC7901、BGC823、AGS胃癌细胞及10例胃癌组织中dnmt1、EZH2. HDAC1的mRNA口蛋白表达水平;免疫共沉淀(Co-IP)检测高分化(MKN28)、中分化(SGC7901)、低分化(BGC823)胃癌细胞及中分化、中·低分化、低分化胃癌组织中dnmt1、EZH2和HDAC1是否形成复合物。结果：dnmt1、EZH2和HDAC1在胃癌细胞和组织中高表达,并且三者在高、中、低分化胃癌细胞以及中、中-低、低分化胃癌组织中均形成复合物。结论：dnmt1、EZH2和HDAC1在胃癌中高表达,并且三者存在相互作用,这可能是胃癌中DNA甲基化与组蛋白修饰存在相关性的重要机制。

关键词： dnmt1 EZH2 HDAC1 胃癌表观遗传组蛋白修饰 H3K27me3 EZH2 癌前病变胃癌

宫内高糖对胎盘炎症因子及子代胰腺Igf2基因印记的影响

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宫内高糖对胎盘炎症因子及子代胰腺Igf2基因印记的影响

作者：刘妙娥浙江大学

学位级别：硕士

第一部分妊娠期糖尿病对胎盘炎症因子的影响目的：研究妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)患者胎盘合成释放炎症因子改变,明确高糖环境对胎盘滋养细胞合成释放炎症因子的影响。材料和方法：获取临床妊娠期糖尿病和正常... 详细信息

第一部分妊娠期糖尿病对胎盘炎症因子的影响目的：研究妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)患者胎盘合成释放炎症因子改变,明确高糖环境对胎盘滋养细胞合成释放炎症因子的影响。材料和方法：获取临床妊娠期糖尿病和正常对照组(Control, C)胎盘组织,采用实时定量PCR、酶联免疫吸附试验检(ELISA)测胎盘炎症因子合成释放改变。体外以生理糖浓度(5mmol/L)和高糖环境(25mmol/L)培养人类滋养细胞系(HTR8/SVneo)48h再加脂多糖(lipopolysaccharide, LPS,1μg/ml)刺激24h,酶联免疫吸附试验检测上清炎症因子释放。结果：GDM组胎盘较C组相比,抗炎因子脂联素(Adiponectin, ADIPOQ)、白细胞介素5(Interleukin5, IL5)、白细胞介素13(Interleukin13, IL13)信使RNA (message RNA, mRNA)表达下降(pdnmt1、dnmt3a、Trim28、Tet1、Aicda表达,免疫组化观察GDM胎鼠胰腺内胰岛素合成情况,并用MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化平台对Igf2甲基化水平进行分析。结果：宫内高糖环境的子一代胎盘白细胞介素6(Interleukin6,I16)表达增加(pdnmt1、Trim28表达上调(pdnmt1、Trim28表达升高及Aicda表达降低,是胰腺印记基因Igf2甲基化水平改变的主要原因。第三部分白细胞介素6和高糖对胎鼠胰腺的影响目的：探索宫内改变环境中影响胎鼠表观遗传变化的主要原因及其可能机制。材料和方法：体外原代培养孕18.5天胎鼠胰腺组织C (glucose5mmol/L), C+IL-6(glucose5mmol/L+IL-64000pg/ml), HG (glucose25mmol/L), HG+IL-6(glucose25mmol/L+IL-64000pg/ml)48h后,利用实时定量PCR检测这四组胰腺印记基因Igf2、胰岛素、dnmt1、Trim28、Aicda表达改变,免疫荧光观察不同培养条件下胎鼠胰腺内胰岛素合成情况,再次利用MassARRAYTM EpiTYPER定量甲基化平台对Igf2甲基化水平进行分析。结果：IL-6或HG培养均可使胎鼠胰腺胰岛素合成减少(pdnmt1、Trim28表达升高(pdnmt1的作用更为明显,而HG对于Trim28的作用更为显著,Aicda表达没有显著差异(p>0.05)。IL-6或HG对Igf2DMR2区有4个CpG位点在IL-6或HG培养条件下出现高甲基化(p<0.05),其中IL-6对CpG、CpG、CpG1

关键词：宫内高糖胎鼠胰腺 Igf2 甲基化胰岛素妊娠期糖尿病炎症因子高糖人类滋养细胞系白细胞介素6 dnmt1 Trim28 CpG岛

半夏泻心汤人含药血清对Hp感染GES-1细胞NF-κB和表观遗传学相关因子mRNA表达的影响

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半夏泻心汤人含药血清对Hp感染GES-1细胞NF-κB和表观遗传学相关...

作者：王亚勤福建中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:从NF-κB信号通路和表观遗传相关因子为切入点,通过检测各组实验血清干预GES-1细胞不同时段后NF-κB、NF-κBp65、IκBα;dnmt1、MBD2、kaiso mRNA表达水平,探讨半夏泻心汤治疗消化性溃疡可能存在的作用机制,丰富中药方剂半夏... 详细信息

研究目的:从NF-κB信号通路和表观遗传相关因子为切入点,通过检测各组实验血清干预GES-1细胞不同时段后NF-κB、NF-κBp65、IκBα;dnmt1、MBD2、kaiso mRNA表达水平,探讨半夏泻心汤治疗消化性溃疡可能存在的作用机制,丰富中药方剂半夏泻心汤用于消化性溃疡的科学内涵。研究方法:1.临床人含药血清收集:临床资料来源分3组,分别是健康对照组、西药组、中药组。健康对照组来自福建省第二人民医院健康体检中心健康志愿者40名,男女各半,年龄200岁。消化性溃疡各药物治疗组来自厦门市中医院、福建省第二人民医院附属国医堂Hp相关性PU之寒热错杂证患者,随机分为两组,各组40名,男女各半,年龄200岁。签署知情同意书。西药组予雷贝拉唑+克拉霉素+甲硝唑,一日两次,口服;中药组予半夏泻心汤液,一日两次,口服。各治疗组予相应药物治疗前及治疗7天后采静脉血,收集、分离血清备用。2.细胞干预与收集:GES-1细胞培养在加有100μg/ml的青霉素、链霉素和10%的胎牛血清的高糖DMEM培养液中,置于37℃、含5%CO的培养箱中生长。与Hp混合时用无抗生素的高糖DMEM培养液。分组后给予相应实验血清培养。设无Hp的GES-1培养液作为空白对照组。另取Hp与GES-1混合液一式6份培养箱中培养24h(从加入Hp即开始计时),1份不加血清干预(即Hp模型组),另5份加入血清干预:健康血清对照组加入健康患者无含药血清;用药前组加患者治疗前血清;西药血清组加入西药组含药血清;中药A、B各组干预培养的血清浓度分别为10%、20%。各组在连续培养1、2、3d后收集各组细胞。3.采用RT-qPCR方法检测各组实验血清干预GES-1细胞24h、48h、72h后NF-κB、NF-κBp65、IκBα;dnmt1、MBD2、kaiso mRNA表达水平。并绘制各自溶解曲线。结果:1.由PCR扩增溶解曲线可知,NF-κB等和GAPDH溶解温度分别在82℃、86℃和86℃左右,说明PCR扩增产物为单一产物。NF-κB等和GAPDH的扩增效率基本一致。2.采用RT-qPCR实验方法检测各组实验血清干预GES-1细胞24h、48h、72h后NF-κB、NF-Bκp65、IκBαmRNA表达,结果显示:与空白组相比,Hp感染模型组NF-κB、NF-κBp65、IκBαmRNA升高,IκBαmRNA降低(P0.05),西药血清组及半夏泻心汤血清组NF-κB、NF-κBp65 mRNA表达降低,IκBαmRNA表达升高(P0.05)。3.采用RT-qPCR实验方法检测各组实验血清干预GES-1细胞24h、48h、72h后dnmt1、MBD2、kaiso mRNA表达,结果显示:与空白组相比,Hp感染模型组dnmt1、kaiso mRNA表达升高(P0.05),西药血清组及半夏泻心汤血清组dnmt1、kaiso mRNA表达降低(Pdnmt1、kaiso mRNA表达降低(P0.05)而MBD2 mRNA表达水平在用药前后各组无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:1.半夏泻心汤人含药血清能降低GES-1细胞中NF-κB、NF-κBp65 mRNA表达水平,升高IκBαmRNA表达水平。2.半夏泻心汤人含药血清能降低GES-1细胞中dnmt1、kaiso mRNA表达水平。3.半夏泻心汤治疗消化性溃疡,其机制与下调NF-κB、NF-κBp65表达水平,而抑制促炎活性;上调IκBα表达水平,减少IκBα磷酸化降解,抑制NF-κB的活化,调节NF-κB信号通路,进而减少Hp相关PU炎症反应,发挥治疗作用有关。通过下调或抑制dnmt1、kaiso mRNA表达,对细胞DNA甲基化进行调控,也可能是其发挥治疗作用的机制之一。

关键词：半夏泻心汤幽门螺杆菌消化性溃疡 NF-κB dnmt1