重楼皂苷Ⅰ以及联合恩杂鲁胺抑制去势抵抗性前列腺癌细胞生长的机制研究

作     者：邹佩良 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：向松涛

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：前列腺癌 重楼皂苷Ⅰ 恩杂鲁胺 HOTAIR EZH2 DNMT1 NF-κB/P65 MUC1 

摘      要：目的:1.体外细胞实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长的抑制作用及分子机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对PC3与DU145细胞生长的抑制增强作用及分子机制。2.体内动物实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌DU145裸鼠移植瘤的抑制作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解重楼皂苷I体内抗前列腺癌机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对DU145裸鼠移植瘤的抑制增强作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解联合给药在体内抗前列腺癌的协同作用机制。方法:第一部分:***法(四甲基偶氮唑盐比色法)观察PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3和DU145细胞的生长是否具有抑制作用及时间与剂量依赖关系;沉默LncRNA HOTAIR对PC3和DU145细胞的生长是否有抑制作用;过表达HOTAIR、EZH2、DNMT1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI对PC3和DU145细胞周期的影响。3.细胞迁移实验(划痕实验)检测PPI对PC3和DU145细胞迁移能力的影响。4.细胞侵袭实验(Transwell侵袭实验)检测PPI对PC3和DU145细胞侵袭能力的影响。***-blot检测不同剂量PPI、转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、EZH2、DNMT1过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2、DNMT1蛋白表达的影响。***-Time-PCR检测PPI对PC3和DU145细胞的HOTAIR表达水平的影响。7.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI以及转染HOTAIR过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2基因启动子活性的影响。8.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测;观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)对肿瘤生长抑制的效果,及对HOTAIR、EZH2、DNMT1表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制作用。第二部分:***法观察PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的抑制效果并分析是否具有协同作用;过表达MUC1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞周期的影响。***-blot分别检测PPI,PPI联合恩杂鲁胺,转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、P65、P50、MUC1过表达质粒对PC3和DU145细胞的P65、P50、MUC1蛋白表达水平的影响。***-Time-PCR检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞HOTAIR、MUC1 mRNA的表达水平的影响;转染P65及MUC1过表达质粒后对细胞HOTAIR表达水平的影响。5.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的MUC1基因启动子活性的影响;转染HOTAIR过表达质粒后对细胞的MUC1基因启动子活性的影响。6.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组、恩杂鲁胺组、重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测,观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)对肿瘤生长抑制的效果,及对NF-ΚB、MUC1和LncRNA HOTAIR表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I联合恩杂鲁胺治疗对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制具有协同作用。结果:第一部分:***法检测细胞活力实验结果:(1)PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性及时间依赖性(P0.05)。(2)沉默HOTAIR可使细胞活力下降,过表达HOTAIR、EZH2、DNMT1可逆转PPI对PC3与DU145细胞生长的抑制作用。2.流式细胞术检测细胞周期结果:(1)与对照组比较,PPI可诱导PC3与DU145细胞周期阻滞于S期(P0.05)。3.细胞迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力结果:(1)与对照组比较,PPI可明显抑制PC3与DU145细胞的迁移能力和侵袭能力(P0.05)。***-blot检测PC3与DU145细胞蛋白表达及Real-Time-PCR检测细胞LncRNA HOTAIR的表达结果:(1)不同剂量PPI处理PC3与DU145细胞后,细胞内EZH2及DNMT1蛋白的表达都呈