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Matrix stiffness exacerbates the proinflammatory responses of vascular smooth muscle cell through the DDR1-DNMT1 mechanotransduction axis

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Bioactive Materials 2022年第11期7卷 406-424页

作者： Jin Wang Si-an Xie Ning Li Tao Zhang Weijuan Yao Hucheng Zhao Wei Pang Lili Han Jiayu Liu Jing Zhou Department of Physiology and Pathophysiology School of Basic Medical SciencesHemorheology CenterSchool of Basic Medical SciencesPeking UniversityBeijingPR China Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Science Ministry of EducationBeijingPR China National Health Commission Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors ResearchPeking UniversityBeijingPR China Department of Gastroenterology Beijing Friendship HospitalCapital Medical UniversityNational Clinical Research Center for Digestive DiseaseBeijing Digestive Disease CenterBeijing Key Laboratory for Precancerous Lesion of Digestive DiseaseBeijingPR China Center for Biomechanics and Bioengineering Key Laboratory of Microgravity(National Microgravity Laboratory)And Beijing Key Laboratory of Engineered Construction and MechanobiologyInstitute of MechanicsChinese Academy of SciencesBeijingPR China School of Engineering Sciences University of Chinese Academy of SciencesBeijingPR China Department of Vascular Surgery Peking University People’s HospitalBeijingPR China Institute of Biomechanics and Medical Engineering School of Aerospace EngineeringTsinghua UniversityBeijingPR China

Vascular smooth muscle cell (vSMC) is highly plastic as its phenotype can change in response to mechanical cues inherent to the extracellular matrix (ECM). VSMC may be activated from its quiescent contractile phenotype to a proinflammatory phenotype, whereby the cell secretes chemotactic and inflammatory cytokines, e.g. MCP1 and IL6, to functionally regulate monocyte and macrophage infiltration during the development of various vascular diseases including arteriosclerosis. Here, by culturing vSMCs on polyacrylamide (PA) substrates with variable elastic moduli, we discovered a role of discoidin domain receptor 1 (DDR1), a receptor tyrosine kinase that binds collagens, in mediating the mechanical regulation of vSMC gene expression, phenotype, and proinflammatory responses. We found that ECM stiffness induced DDR1 phosphorylation, oligomerization, and endocytosis to repress the expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1), very likely in a collagen-independent manner. The DDR1-to-DNMT1 signaling was sequentially mediated by the extracellular signal-regulated kinases (ERKs) and p53 pathways. ECM stiffness primed vSMC to a proinflammatory phenotype and this regulation was diminished by DDR1 inhibition. In agreement with the in vitro findings, increased DDR1 phosphorylation was observed in human arterial stiffening. DDR1 inhibition in mouse attenuated the acute injury or adenine diet-induced vascular stiffening and inflammation. Furthermore, mouse vasculature with SMC-specific deletion of DNMT1 exhibited proinflammatory and stiffening phenotypes. Our study demonstrates a role of SMC DDR1 in perceiving the mechanical microenvironments and down-regulating expression of DNMT1 to result in vascular pathologies and has potential implications for optimization of engineering artificial vascular grafts and vascular networks.

关键词： Matrix stiffness Inflammation DDR1 DNMT1 Mechanotransduction

白背飞虱DNMT1基因的结构特点及在雌雄成虫中的差异表达

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中山大学学报（自然科学版）（中英文） 2022年第2期61卷 76-81页

作者：何静怡杨梅林佳梁安文李广宏王方海有害生物控制与资源利用国家重点实验室/中山大学生命科学学院广东广州510275

DNA甲基转移酶1(DNMT1)是基因组DNA甲基化关键酶之一,在生物的生长发育过程中起到重要的调控作用。本研究在白背飞虱(Sogatella furcifera)转录组测序结果中找到一条带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的DNMT1基因的cDNA序列,全长为4524 ... 详细信息

DNA甲基转移酶1(DNMT1)是基因组DNA甲基化关键酶之一,在生物的生长发育过程中起到重要的调控作用。本研究在白背飞虱(Sogatella furcifera)转录组测序结果中找到一条带有起始密码子ATG和终止密码子TGA的DNMT1基因的cDNA序列,全长为4524 bp,编码的蛋白质具有DNMT1的典型结构:位于N端的DN⁃MT相关蛋白结合结构域,复制灶靶向序列,富含半胱氨酸的锌指结构域和聚溴同源结构域,以及位于C端的催化结构域。进一步与白背飞虱全基因组序列进行比对,发现白背飞虱DNMT1基因位于白背飞虱第3号染色体上,全长为22567 bp,含有18个外显子和17个内含子。该基因主要在白背飞虱腹部表达,且在雌成虫中的表达量明显高于雄成虫,达4.3倍。本研究将增进对昆虫dnmts的具体结构和生物学功能的认识,并为探索新的防治稻飞虱的方法或途径提供理论基础。

关键词： DNMT1 白背飞虱(Sogatella furcifera) 开放阅读框基因表达

双氢青蒿素通过调控uhrf1、DNMT1、p16^(ink4a)影响前列腺癌种植瘤的生长

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基因组学与应用生物学 2022年第8期41卷 1808-1816页

作者：刘思豪夏僮周驷杰罗子国重庆医科大学生命科学研究院重庆市400016

为了探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对前列腺癌PC-3细胞种植瘤的影响,利用前列腺癌PC-3细胞构建经典的种植瘤模型,成瘤后每两天用DHA干预一次,第13天取材,计算抑瘤率;光镜和电镜观察瘤组织形态学改变;TUNEL染色计数凋亡细胞并... 详细信息

为了探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对前列腺癌PC-3细胞种植瘤的影响,利用前列腺癌PC-3细胞构建经典的种植瘤模型,成瘤后每两天用DHA干预一次,第13天取材,计算抑瘤率;光镜和电镜观察瘤组织形态学改变;TUNEL染色计数凋亡细胞并计算凋亡率;实时荧光定量PCR检测uhrf1、DNMT1、p16^(ink4a)mRNA表达水平;蛋白印迹检测UHRF1、DNMT1、P16ink4a蛋白表达水平;免疫组化检测UHRF1、DNMT1、P16ink4a蛋白定位及表达。结果显示:DHA能够抑制前列腺癌PC-3细胞在裸鼠体内的生长,诱导PC-3细胞发生凋亡和坏死的形态学改变;RT-qPCR、蛋白印迹及免疫组化结果表明DHA能够降低PC-3细胞中uhrf1及DNMT1的表达水平,升高p16^(ink4a)的表达水平。总之,DHA能够有效地抑制裸鼠前列腺癌种植瘤的生长。这可能与下调uhrf1及DNMT1的表达,恢复抑癌基因p16^(ink4a)的表达,诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡有关。

关键词：双氢青蒿素前列腺癌 uhrf1 p16^(ink4a) DNMT1

DNMT1和dnmt3b在唾液腺黏液表皮样癌中的表达及意义

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上海口腔医学 2018年第3期27卷 275-279页

作者：王智明王星翱张世坤王喜中王丽张新悦刘楠楠唐颜颜中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科辽宁沈阳110004

目的:探讨DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,dnmt)在唾液腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)中的表达及意义。方法:选取2010年1月—2013年9月间中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科手术切除的唾液腺术后的标本43例,正... 详细信息

目的:探讨DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,dnmt)在唾液腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)中的表达及意义。方法:选取2010年1月—2013年9月间中国医科大学附属盛京医院口腔颌面外科手术切除的唾液腺术后的标本43例,正常唾液腺组织17例,应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测正常组织及MEC组织中DNMT1和dnmt3b的表达。采用SPSS22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:DNMT1在MEC组织中的阳性表达率为37.21%,与正常唾液腺组织的17.65%相比,差异无显著性(P>0.05);dnmt3b在MEC组织中的阳性表达率为83.72%,显著高于正常唾液腺组织的11.76%(P0.05)。结论:dnmt3b在唾液腺MEC的发生中可能发挥一定作用。

关键词：唾液腺黏液表皮样癌 DNMT1 dnmt3b

K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2甲基化关系的研究

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中国实验血液学杂志 2018年第2期26卷 401-406页

作者：刘学东刘晓郭秀芬罗建民李英华衡水市中心血站哈励逊国际和平医院血液科河北衡水053000 河北医科大学第二医院血液科河北石家庄050000

目的:探讨慢性髓系白血病(CML)急变细胞系K562细胞中DNA甲基转移酶1(DNMT1)与造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因表达及其启动子2的甲基化状态的关系。方法:分析NCBI数据库中SHP-1基因启动子2启动子区序列。将携带DNMT1sh RNA的psi HIV-m U6-sh ... 详细信息

目的:探讨慢性髓系白血病(CML)急变细胞系K562细胞中DNA甲基转移酶1(DNMT1)与造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因表达及其启动子2的甲基化状态的关系。方法:分析NCBI数据库中SHP-1基因启动子2启动子区序列。将携带DNMT1sh RNA的psi HIV-m U6-sh DNMT1和樱桃色荧光蛋白(mcherry FP)psi HIV-m U6-control的慢病毒干扰载体感染K562细胞系。应用甲基化特异的聚合酶链反应(MSP)和亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测K562细胞中SHP-1基因启动子2的甲基化状态,Western blot检测SHP-1、DNMT1蛋白的表达水平,SYBR Green荧光定量PCR检测SHP-1 m RNA的表达。结果:SHP-1基因启动子2在-353 bp-+182 bp区有22个Cp G岛,K562细胞中SHP-1基因启动子2异常高甲基化且SHP-1蛋白表达缺失。K562细胞转染psi HIV-m U6-sh DNM T1后DNM T1表达水平为0.48±0.06,较转染psi HIV-m U6-control组明显降低(1.33±0.19)(t=4.18,P=0.014)。K562细胞中SHP-1蛋白表达缺失,转染psi HIV-m U6-sh DNM T1后K562细胞SHP-1蛋白恢复表达,转染psi HIV-m U6-sh DNM T1的K562细胞中SHP-1 m RNA相对表达水平(14.23±3.83)较转染psi HIV-m U6-control组(1.031±0.156)高(P=0.004)。DNMT1基因沉默后SHP-1基因启动子2中Cp G岛去甲基化。结论:K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2的异常甲基化及沉默相关。

关键词： SHP-1 DNMT1 K562细胞启动子甲基化

Protein expression trends of DNMT1 in gastrointestinal diseases:From benign to precancerous lesions to cancer

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World Journal of Gastrointestinal Oncology 2019年第12期11卷 1141-1150页

作者： Tian-Miao Ma Li-Ping Sun Nan-Nan Dong Ming-Jun Sun Yuan Yuan Department of Gastroenterology the First Hospital of China Medical UniversityShenyang 110001Liaoning ProvinceChina Tumor Etiology and Screening Department of Cancer Institute and General Surgery the First Hospital of China Medical UniversityShenyang 110001Liaoning ProvinceChina

BACKGROUND In recent years,the incidence of gastrointestinal(GI)cancer in China has increased annually.Early detection and appropriate therapy are considered to be the key to treat GI cancer.DNMT1 takes an active part in the advancement of GI cancer,which will change as the disease progresses.But its expression characteristics in the dynamic variations of GI carcinogenesis are still unclear.AIM To investigate the expression characteristics of DNMT1 in different GI diseases.METHODS We detected the expression of DNMT1 in 650 cases of different GI diseases by immunohistochemistry,including 90 cases of chronic superficial gastritis(CSG),72 cases of atrophic gastritis with intestinal metaplasia(AG/GIM),54 cases of low-grade intraepithelial neoplasia(GLIN),66 cases of high-grade intraepithelial neoplasia(GHIN),71 cases of early gastric cancer(EGC),90 cases of normal intestinal mucosa(NIM),54 cases of intestinal low-grade intraepithelial neoplasia(ILIN),71 cases of intestinal high-grade intraepithelial neoplasia(IHIN),and 82 cases of early colorectal cancer(ECRC).RESULTS In the CSG group,all cases showed weakly positive or negative expression of DNMT1.However,in other four groups(AG/GIM,GLIN,GHIN,and EGC),the positive expression rate gradually increased with the severity of the diseases;the negative or weakly positive cases accounted for 55.56%(40/72),38.89%(21/54),1.52%(1/66),and 1.41%(1/71),respectively.Besides,the moderately positive cases were 44.44%(32/72),57.41%(31/54),80.30%(53/66),and 43.66%(31/71),respectively.The strongly positive cases only existed in the GLIN(3.70%,2/54),GHIN(18.18%,12/66),and EGC(54.93%,39/71)groups.The differences between any two groups were statistically significant(PDNMT1 were predominant(91.11%,82/90),and the rest were moderately positive cases(8.89%,8/90).In the ILIN,IHIN,and ECRC groups,the rates of cases with weak or negative expression of DNMT1 were 46.30%(25/54),12.68%(9/71),and 4.88%(4/82),respectively;with

关键词： Gastric cancer Colorectal cancer DNMT1 Precancerous lesion Intraepithelial neoplasia

DNMT1在结直肠癌中的表达及对增殖、迁移和侵袭的影响

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DNMT1在结直肠癌中的表达及对增殖、迁移和侵袭的影响

作者：赵欢河北北方学院

学位级别：硕士

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率和死亡率逐年升高。癌基因和抑癌基因甲基化是结直肠癌发生发展过程中重要的表观遗传学事件,肿瘤癌基因和抑癌基因启动子区域的DNA甲基化可以调控基因的表达... 详细信息

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率和死亡率逐年升高。癌基因和抑癌基因甲基化是结直肠癌发生发展过程中重要的表观遗传学事件,肿瘤癌基因和抑癌基因启动子区域的DNA甲基化可以调控基因的表达,进而影响肿瘤的增殖、侵袭和转移。DNA甲基转移酶1(DNMT1)是DNA甲基化过程中重要的功能酶,在DNA甲基化建立和维持中起着重要作用。研究发现DNMT1参与了多种肿瘤细胞的基因转录、肿瘤干细胞的增殖和分化、肿瘤血管的生成等生物过程的调控,其在结直肠癌中的作用机制尚未系统探究。本研究收集了167例临床病理资料完整的结直肠癌石蜡组织样本。随机选取其中24例淋巴结未转移结直肠癌及其配对癌旁组织(A组)和20例淋巴结转移结直肠癌及其配对癌旁组织(B组),应用逆转录PCR(q RT-PCR)检测结直肠癌及癌旁组织中DNMT1 m RNA的表达情况。结果显示,未发生淋巴结转移(A组)的癌组织及其配对癌旁组织DNMT1 m RNA表达无统计学差异(P>0.05),而发生淋巴结转移的癌组织(B组)DNMT1 m RNA表达显著低于其配对癌旁组织(PDNMT1在结直肠癌中的表达情况,采用免疫组化半定量法评估167例结直肠癌及其癌旁组织DNMT1蛋白表达水平,分析DNMT1的表达与结直肠癌临床病理特征间的关系。结果显示:在167例肿瘤样本中,59.9%(100\167)癌组织DNMT1呈低表达;40.1%(67\167)病例癌组织呈高表达。DNMT1在淋巴结转移结直肠癌(55\75)原发病灶中的表达显著低于癌旁组织(P1)。DNMT1表达与肿瘤分化程度(P1)、浸润深度(P=0.018)、淋巴结转移(P=0.002)及TNM分期(P1)等临床病理特征密切相关,而与患者年龄、性别、肿物大小无关。以上结果提示DNMT1的表达降低与结直肠癌侵袭、转移可能存在相关性。为了探究DNMT1异常表达在结直肠癌侵袭转移中的作用机制,我们体外培养了正常肠上皮细胞株NCM460和结直肠癌细胞株HCT-8,应用逆转录实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测两株细胞DNMT1m RNA的表达水平,结果显示,HCT-8细胞DNMT1 m RNA表达水平略高于NCM460。通过LV-h DNMT1-sh RNA慢病毒转染结直肠癌细胞株HCT-8,下调DNMT1在结直肠癌细胞系中表达,实验设置为空白对照组(未进行干预,Blank)、阴性对照组(转染空载慢病毒,sh NC)、实验组(转染LV-h DNMT1-sh RNA慢病毒,sh DNMT1),转染结果显示,与NCM460及对照组比,实验组DNMT1基因和蛋白表达水平显著降低;同时应用CCK8和平板集落形成实验检测细胞的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果显示,与对照组比,实验组细胞增殖、迁移和侵袭能力增强,说明DNMT1表达降低促进了细胞增殖、迁移和侵袭。为了进一步探究DNMT1在结直肠癌增殖、迁移及侵袭作用中的分子机制,我们应用逆转录实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot方法检测各组细胞ki-67、MMP9、TIMP3在m RNA和蛋白水平的表达;亚硫酸氢盐甲基化特异性PCR(MSP)检测ki-67、MMP9和TIMP3的甲基化水平。结果显示,实验组ki-67 m RNA和蛋白表达增高(P0.05);MMP9 m RNA和蛋白表达显著升高,其甲基化水平显著降低(PDNMT1低表达引起ki-67、MMP9高表达和TIMP3低表达,促进了肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,其中MMP9及TIMP3的甲基化可能参与这些基因的表达调控。综上所述,本研究首先在淋巴结转移结直肠癌中发现了DNMT1表达降低现象及其与肿瘤淋巴结转移的相关性,并在细胞学水平进行实验证实。研究发现体外细胞基因转染降低DNMT1表达,结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭显著增强,表现为ki-67、MMP9基因及蛋白表达水平显著升高,TIMP3基因及蛋白表达水平显著降低。进一步实验证实,该过程中还伴随着MMP9甲基化水平降低,TIMP3甲基化水平升高,表明DNMT1表达降低促进了肿瘤细胞增殖、侵袭和转移,MMP9和TIMP3基因甲基化可能参与了基因表达调控。这为结直肠癌转移表观遗传学的机制提供了重要的实验证据。

关键词：结直肠癌 DNMT1 侵袭转移临床病理细胞侵袭细胞迁移

DNMT1对胃癌细胞迁移、增殖、凋亡的作用及机制研究

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DNMT1对胃癌细胞迁移、增殖、凋亡的作用及机制研究

作者：郭梦琦河南中医药大学

学位级别：硕士

目的:验证DNMT1在胃癌细胞中的异常表达,观察DNMT1对胃癌细胞迁移、增殖、凋亡的作用,并通过生信技术筛选DNMT1的上游分子机制。方法:1.通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白印迹(western blot)检测DNMT1在正常胃上皮细胞(GES-1)和胃癌... 详细信息

目的:验证DNMT1在胃癌细胞中的异常表达,观察DNMT1对胃癌细胞迁移、增殖、凋亡的作用,并通过生信技术筛选DNMT1的上游分子机制。方法:1.通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白印迹(western blot)检测DNMT1在正常胃上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901、MKN-28)中m RNA水平和蛋白水平的相对表达量。2.使用小干扰RNA(si RNA)技术抑制胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901)中DNMT1的表达,并通过RT-q PCR和WB检测si RNA的干扰效果。运用细胞划痕法、CCK-8法和流式细胞技术观察DNMT1对胃癌细胞迁移、增殖、凋亡的影响。3.在Target Scan数据库、miRDB数据库、ENCORI数据库中预测DNMT1的上游miRNA,使用韦恩图软件将结果进行交集。使用miRanda软件分析交集中miRNA与DNMT1的结合程度以及热力学稳定性,根据分析结果,通过RTq PCR在正常胃上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901、MKN-28)中进行验证。4.设计miR-4644 mimics转染胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901),使用RT-q PCR和WB检测过表达miR-4644后DNMT1 RNA和蛋白的表达量变化,进一步探讨miR-4644对DNMT1的影响。5.在DIANA数据库、ENCORI数据库、star Base数据库中预测miR-4644的上游lnc RNA,使用韦恩图软件将结果进行交集。通过RT-q PCR检测三个数据库中共有的lnc RNA在正常胃上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(MGC-803、SGC-7901)中的相对表达量,确定与miR-4644—DNMT1相互影响的lnc RNA。结果:1.与正常胃上皮细胞GES-1相比,DNMT1 RNA在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、MKN-28中分别高表达了6.9倍、9.1倍、3.1倍(P均1);DNMT1蛋白在胃癌细胞MGC-803中高表达了3.1倍(P1),在SGC-7901和MKN-28中分别高表达了2倍和2.4倍(P均DNMT1后,MGC-803和SGC-7901细胞的迁移率分别降低了45%和54%(P均1);24小时细胞活力分别降低了28.8%(P1)和6.1%(P1)和31.1%(PDNMT1能够使SGC-7901细胞的凋亡率提高60%(P0.05)。3.三个数据库交集出8个DNMT1可能的上游miRNA,即:hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3163、hsa-miR-4306、hsa-miR-4644、hsa-miR-5094。其中hsa-miR-4644在结合程度排名中位居第四。经细胞株验证,miR-4644在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、MKN-28中异常低表达(P均1中敲低DNMT1后,miR-4644的表达量分别增高了79%(P1)和38%(P1,转染后miR-4644的表达量显著提高(P均1);DNMT1的RNA表达量分别降低了32%和39%(P均1);DNMT1的蛋白表达量分别降低了17%(P1)。5.三个数据库交集出3个miR-4644可能的上游lnc RNA:XIST、MALAT1、ZNF674-AS1。在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901过表达miR-4644后,ZNF674-AS1的表达量分别下降了41%和82%(P均1细胞敲低DNMT1后,ZNF674-AS1的表达量分别下降了42%(P1)。结论:1.DNMT1在胃癌细胞MGC-803、SGC-7901、MKN-28中高表达。抑制DNMT1的表达能够抑制胃癌细胞MGC-803、SGC-7901的迁移和增殖,促进胃癌细胞SGC-7901的凋亡,但对MGC-803的凋亡水平没有影响。2.miR-4644在胃癌细胞MGC-803及SGC-7901中抑制DNMT1的表达。在胃癌细胞MGC-803及SGC-7901中,lnc RNA ZNF674-AS1、miR-4644、DNMT1之间存在相互影响。

关键词： DNMT1 迁移增殖凋亡 miRNA lncRNA 胃癌

MiR-216a通过调控DNMT1减轻慢性阻塞性肺疾病小鼠肺血管内皮细胞凋亡

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MiR-216a通过调控DNMT1减轻慢性阻塞性肺疾病小鼠肺血管内皮细胞...

作者：林铃中南大学

学位级别：硕士

目的:慢性阻塞性肺疾病,简称慢阻肺,是一种常见的慢性呼吸系统疾病。吸烟是慢阻肺常见的关键危险因素,吸烟诱导的肺血管内皮细胞凋亡是导致慢阻肺发生的重要机制之一。本研究对慢阻肺模型小鼠和对照组小鼠肺组织进行微阵列基因芯片分析... 详细信息

目的:慢性阻塞性肺疾病,简称慢阻肺,是一种常见的慢性呼吸系统疾病。吸烟是慢阻肺常见的关键危险因素,吸烟诱导的肺血管内皮细胞凋亡是导致慢阻肺发生的重要机制之一。本研究对慢阻肺模型小鼠和对照组小鼠肺组织进行微阵列基因芯片分析,发现miR-216a在慢阻肺小鼠肺组织中表达降低。然而miR-216a是否参与慢阻肺的发生发展尚未有报道。因此本研究旨在探讨:(1)验证香烟烟雾暴露联合腹腔注射香烟烟雾提取物(CSE)诱导的慢阻肺模型小鼠肺组织中miR-216a以及DNMT1的表达情况;(2)探索miR-216a能否通过调控DNMT1减轻CSE诱导的小鼠肺血管内皮细胞凋亡。方法:(1)利用香烟烟雾暴露联合腹腔注射CSE的方法构建慢阻肺小鼠模型;通过HE染色检测小鼠肺气肿情况,TUNEL染色检测小鼠肺组织细胞凋亡的情况。采用qRT-PCR检测小鼠肺组织中miR-216a的表达,Western blot检测小鼠肺组织DNMT1与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的表达;(2)提取原代小鼠肺血管内皮细胞(MPVECs)并培养,通过流式细胞术检测不同浓度(0、1%、2%、4%)CSE溶液干预的MPVECs凋亡率,同时检测miR-216a的表达;将miR-216a mimic转染至MPVECs并给予2%CSE干预24h后,检测MPVECs的凋亡率、miR-216a的表达以及DNMT1、Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-216a是否与DNMT13’UTR直接结合。以慢病毒为载体过表达DNMT1的Lenti-DNMT1以及miR-216a mimic同时转染至MPVECs中,随后给予2%CSE干预24h,检测DNMT1、Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。结果:(1)与对照组小鼠相比,慢阻肺小鼠肺组织出现明显的肺气肿病理改变;同时慢阻肺小鼠肺组织细胞凋亡程度明显增加;慢阻肺小鼠肺组织miR-216a表达降低而DNMT1表达明显增加。(2)MPVECs的细胞凋亡率随着CSE浓度的增加而逐渐增加;miR-216a的表达水平在CSE应激的MPVECs中明显下降,而DNMT1的表达增加;过表达miR-216能够减轻CSE诱导的MPVECs凋亡,并且降低DNMT1、Bax及Cleaved caspase-3的表达,增加Bcl-2的表达。双荧光素酶报告基因检测实验证实了miR-216a能够与DNMT1的3’UTR直接结合;此外,过表达DNMT1能够逆转miR-216a在CSE诱导的MPVECs的抗凋亡作用,增加Bax及Cleaved caspase-3的表达,且降低Bcl-2的表达。结论:miR-216a可能通过调控DNMT1的表达减轻慢阻肺小鼠肺血管内皮细胞凋亡。表3个,图12个,参考文献66篇

关键词：慢性阻塞性肺疾病 miR-216a DNMT1 小鼠肺血管内皮细胞凋亡