YY1基因对水牛植入前胚胎DNA甲基化影响的初步研究

作     者：龚云 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李湘萍;陆凤花

授予年度：2013年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：水牛YY1基因 DNA甲基化 RNA干扰 DNMT1 

摘      要：阴阳因子1(YY1)是一种广泛存在于生物体中并在进化上高度保守的转录因子,它可以作为基因表达过程中的激活因子和抑制因子参与许多基因的转录调控。为了解YY1基因在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对DNA甲基化的影响和调控作用,本研究克隆了水牛YY1基因编码序列,构建了其真核表达载体;筛选抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段,同时探讨了YY1基因过表达对水牛胚胎早期发育及DNA甲基化的影响。 1.水牛YYl基因CDS全长序列克隆及其真核表达载体构建。以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR和降落PCR的方法,扩增水牛YY1基因CDS全长序列。将目的片段连接到pEGFP-N1载体中构建真核表达载体,然后转染293T细胞和水牛成纤维细胞(BFF),通过荧光观察和qRT-PCR方法检测YY1基因表达情况。结果显示,克隆得到的水牛YY1基因CDS全长序列为1248bp,与牛、人、小鼠、大鼠及鸡的同源性达到90%以上。重组质粒pYY1-EGFP-N1可在293T细胞和水牛成纤维细胞中表达;在水牛体细胞水平上,YY1基因表达可促进DNMT1基因的表达。 2.水牛YY1基因表达shRNA干扰片段的筛选。以黄牛YY1基因编码区序列为模板,设计并合成2条shRNA片段,构建其慢病毒表达载体pSicoR-GFP-YY1shRNA1/2。将构建的过表达水牛YY1基因真核表达载体与shRNA表达载体分别以1：1和1：6的比例进行共转染,以pSicoR-GFP和pSicoR-GFP-1864质粒作为空白和阴性对照。采用qRT-PCR和Western-blot方法检测shRNAs的抑制效率。结果发现,设计合成的2条shRNA序列对水牛YY1基因表达均有抑制效果;定量结果显示,pSicoR-GFP-YY1shRNA2(93.64%)的抑制效果显著高于shRNA1(53.77%)。 ***1基因过表达对水牛胚胎发育及DNA甲基化的影响。采用线性化处理的质粒,对体外受精8-10h后的水牛受精卵进行卵胞质注射。分析质粒注射浓度、不同外源DNA质粒对水牛胚胎发育及外源基因表达状况的影响;同时采用qRT-PCR方法分析YY1基因过表达对植入前胚胎发育及DNMT1基因表达的影响。结果发现,受精卵胞质注射25μg/mL pYY1-EGFP-N1质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P0.05),并取得较高表达EGFP的囊胚比例(33.3%),显著高于其他注射浓度(5,15,50μg/mL)(P0.05),注射pYY1-EGFP-N1质粒组的囊胚发育率与未注射组相比差异不显著(P0.05);YY1和DNMT1基因在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势,随着胚胎的发育,YY1基因的表达逐渐增高,囊胚期达到最高,相反,DNMT1基因在桑葚胚前表达较高,囊胚期表达最低;YY1基因过表达在胚胎水平上会增加DNMT1基因表达,提高水牛胚胎DNA甲基化水平。 结论：克隆得到的水牛YY1基因CDS全长序列在生物进化上具有高度保守性;构建的pEGFP-N1-YY1重组质粒可以转染水牛体细胞,YY1基因过表达在体细胞水平上会促进DNMT1基因的表达;筛选得到的2条shRNA干扰序列均能有效抑制水牛YY1基因的表达;水牛植入前胚胎YY1和DNMT1基因的表达模式呈相反的趋势,YY1基因过表达使水牛胚胎DNMT1基因的表达量增高,提高胚胎DNA甲基化水平。