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激活型dna纳米探针用于活细胞内MicroRNA的生物传感和精准成像

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分析化学 2023年第5期51卷 811-820页

作者：李雨彦张宏艳刘文栋邵明政张瑞中张立兵天津大学理学院化学系天津市分子光电科学重点实验室

新型生物标记物的识别与检测促进了检测技术的快速发展。MicroRNA(miRNA)是癌症诊断和预后的一种特异性生物标志物，因此，实现miRNA的精准检测对于疾病诊断具有重要的研究意义。近年来，dna荧光纳米探针逐渐发展成为一种监测和分析miRN... 详细信息

新型生物标记物的识别与检测促进了检测技术的快速发展。MicroRNA(miRNA)是癌症诊断和预后的一种特异性生物标志物，因此，实现miRNA的精准检测对于疾病诊断具有重要的研究意义。近年来，dna荧光纳米探针逐渐发展成为一种监测和分析miRNA以及细胞和生命体动态变化过程的有效工具。然而，由于传统的dna纳米探针存在易受生物自身荧光干扰、脱靶效应以及缺乏时空控制等问题，在获得高精度和高分辨率的成像信号方面仍存在一定的局限性。激活型dna纳米探针作为一种新型探针，可通过外源性或内源性因素调节其成像和传感性能，展示出克服这些局限性的良好潜力。本文综述了近年来激活型dna纳米探针的设计与构建及其在复杂生物系统中进行miRNA生物成像与传感方面的研究进展，并分析了激活型纳米探针的发展前景和所面临的挑战。

关键词： dna纳米探针 MicroRNA 生物传感精准成像生物标志物评述

dna纳米探针的构建及其在细胞凋亡成像分析中的应用

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DNA纳米探针的构建及其在细胞凋亡成像分析中的应用

作者：林华容西南大学

学位级别：硕士

细胞凋亡,又名程序性细胞死亡,对细胞的生长、增殖有着重大影响,在生物体内受到凋亡相关分子的严格调控。细胞凋亡的平衡一旦被打破(凋亡过度或凋亡不足),则会产生各种疾病问题,比如恶性肿瘤、移植排斥反应、神经退行性疾病等。因此构... 详细信息

细胞凋亡,又名程序性细胞死亡,对细胞的生长、增殖有着重大影响,在生物体内受到凋亡相关分子的严格调控。细胞凋亡的平衡一旦被打破(凋亡过度或凋亡不足),则会产生各种疾病问题,比如恶性肿瘤、移植排斥反应、神经退行性疾病等。因此构建简单、灵敏的分析方法监测细胞凋亡过程中凋亡相关分子含量变化,对于进一步了解凋亡过程、凋亡机制、凋亡途径、药物疗效评价等具有重要意义。传统的细胞凋亡检测方法往往操作繁琐、耗时,且需要固定或裂解细胞后提取凋亡相关标志物,难以对凋亡过程进行原位实时动态监测。同时,细胞内成分复杂,而凋亡标志物往往丰度较低,要求分析方法具备较高的准确度和灵敏度。dna具有易合成、生物相容性好等诸多优点,近年来也得到了广泛的关注。但细胞内环境复杂,尤其是核酸酶等会影响dna结构的稳定性和功能,因此如何构建稳定性好、灵敏度高的dna纳米探针,实现细胞内凋亡标志物的检测和成像分析,仍然极具挑战。基于以上问题,本文构建了两种生物相容性好、稳定性高的dna纳米探针,利用纳米金属表面能量转移(Nanometal surface energy transfer,NSET)降低背景信号,结合空间限制和催化发卡自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)循环放大功能,实现凋亡相关分子的灵敏检测。同时,借助具有实时无创、高时空分辨率等优点的荧光成像技术,对药物诱导细胞凋亡过程中细胞内低丰度的凋亡相关分子含量变化进行原位实时监测。开展的研究内容具体如下:1.Au NPs-dna球核酸纳米探针的构建及其在细胞凋亡过程中miR-630的实时成像分析中的应用在生物体内,miRNA参与了分化、凋亡等多个生理过程,Micro RNAome分析表明miR-630参与了凋亡过程的调节。因此,本研究构建了一种Au NPs-dna球核酸纳米探针(Au NPs-dna),用于实时监测细胞凋亡过程中miR-630的含量变化。在此研究中,设计了一条与miR-630完全互补的dna序列(reporter,TAMRA-dna),以及一条与reporter部分互补的dna序列(blocker,SH-dna),以金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au NPs)为载体,两条dna在杂交后通过金-硫键偶联到Au NPs表面,组装形成Au NPs-dna。Au NPs与TAMRA之间发生NSET,导致TAMRA荧光被猝灭。当miR-630存在时,其会与TAMRA-dna杂交形成另一条双链结构并从Au NPs-dna中释放,产生荧光信号恢复,利用该信号变化构建miR-630的检测方法,实现了miR-630快速(10分钟)、宽线性范围检测(0.5–120nmol/L)。由于Au NPs对其表面dna具有保护作用,可使dna免于核酸酶降解,长时间保持稳定。将Au NPs-dna应用于A549细胞凋亡过程中miR-630的实时监测,结果表明在星形孢菌素(STS)诱导凋亡的过程中,细胞内miR-630的表达逐渐升高。研究还发现,用不同的抗肿瘤药物诱导凋亡时,miR-630的表达也有一定升高,和文献报道相一致,进一步表明miR-630可能参与了细胞凋亡的调节。以上结果表明,Au NPs-dna具有低背景、稳定等优点,实现了miR-630的快速灵敏检测及其在细胞凋亡过程中的成像分析,有望用于凋亡机制研究及抗癌药物筛选等。2.dna三棱柱组装体的构建及其在细胞凋亡过程中MnSOD mRNA的实时监测中的应用mRNA在生物体内具有指导蛋白合成的功能,其中MnSOD mRNA作为在凋亡途径中的上游信号分子吸引了研究者们的关注。由于细胞内MnSOD mRNA丰度较低,因此要求分析方法具备高的灵敏度。因此,本研究基于dna三棱柱(DTP)的空间限制和CHA的信号放大功能,构建了一种分子内CHA组装体(intra-CHA3)用于MnSOD mRNA的灵敏检测。本设计通过DTP上的单链部分延伸出三对“dna援手”,借助“援手”将3对相同的发卡组装到同一DTP上。MnSOD mRNA存在时会打开H,分离H上的Cy3和BHQ-2,导致Cy3荧光信号恢复。随后,H与邻近H反应并释放出MnSOD mRNA。基于DTP的空间限制,低浓度MnSOD mRNA在发生一次CHA循环释放后会进一步与同一DTP上其余的H反应,实现分子内CHA循环信号放大。实验结果表明,随着MnSOD mRNA浓度增加,Cy3的荧光信号也逐步增加,MnSOD mRNA浓度与荧光信号在0.05–10 nmol/L范围内有很好的线性关系,检测限为30 pmol/L。和游离CHA(free CHA)相比,检测限下降了30倍;与分子内含一对CHA的组装体(intra-CHA1)相比,检测限下降了8倍。以DTP作为载体,有利于发卡分子进入细胞并提高发卡的稳定性。将intra-CHA3用于细胞内MnSOD mRNA的成像

关键词： dna纳米探针细胞凋亡 miR-630 MnSOD mRNA 成像分析

两种高灵敏dna纳米探针的构建及其在分子检测中的应用研究

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两种高灵敏DNA纳米探针的构建及其在分子检测中的应用研究

作者：蔡婧怡西安建筑科技大学

学位级别：硕士

小分子标志物的灵敏检测是疾病诊断、环境分析和食品安全等领域的重要需求,因此开发高效的小分子检测方法具有重要意义。传统的检测方法是以抗体、酶等作为识别元件和目标物进行反应,再通过对识别信号的放大来实现目标物的检测,但整个... 详细信息

小分子标志物的灵敏检测是疾病诊断、环境分析和食品安全等领域的重要需求,因此开发高效的小分子检测方法具有重要意义。传统的检测方法是以抗体、酶等作为识别元件和目标物进行反应,再通过对识别信号的放大来实现目标物的检测,但整个过程往往存在实验周期长、操作复杂、灵敏度不足等问题。dna作为一种分子识别元件具有特异性识别多种目标分子的能力,由此发展的dna信号扩增方法具有高灵敏度、检测范围宽和特异性强的优势,因此,是构建高灵敏检测探针的良好选择。本工作围绕小分子目标物检测中存在的问题,结合dna纳米技术和功能纳米材料,通过电化学、荧光等分析技术,构建高灵敏的小分子检测方法,为低丰度抗生素和肿瘤标志物microRNA-21(miRNA-21)的检测提供新思路。具体研究内容如下:(1)利用适配体的特异性识别能力和磁性dna walker优异的信号放大性能,构建了磁性dna walker电化学传感器,用于卡那霉素(Kana)的精准检测。研究结果显示,电化学传感器中的核酸适体可以特异性识别Kana,而磁性dna walker不仅可以通过级联扩增反应放大目标信号,还可以通过磁分离有效降低背景干扰,从而保证了复杂样品中Kana检测的灵敏度和准确性。该电化学传感器线性范围宽(10 fM～1 μM),检测限低至0.02 fM。此外,优异的选择性使该传感器具有从其他抗生素甚至牛奶中特异性识别Kana的能力。本研究提出的电化学传感平台为环境中残留抗生素的检测提供了可靠的工具。(2)利用金纳米颗粒(AuNPs)作为递送载体,构建了由三磷酸腺苷和端粒酶辅助激活的dna四链体杂化物-dna三链体杂化物-AuNPs(FD-SD-AuNPs)纳米探针,用于活细胞内miRNA-21的精准原位成像分析。AuNPs作为递送载体使得FD-SD-AuNPs纳米探针表现出出色的细胞内化能力及核酸酶抗性。双重辅助激活型纳米探针避免了在复杂细胞环境中假阳性信号的产生,同时,熵驱动级联链置换扩增技术提高了检测灵敏度。实验结果表明,该FD-SD-AuNPs纳米探针对miRNA-21的检测具有高灵敏度和选择性。此外,共聚焦成像结果显示,该纳米探针可用于活细胞内miRNA-21的原位成像。本工作构建的纳米探针为细胞内低丰度标志物的精准检测提供了可靠的策略。

关键词： dna纳米探针电化学传感器荧光成像抗生素 MicroRNA

三维dna纳米探针用于活细胞内生物标志物的检测及动态成像

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三维DNA纳米探针用于活细胞内生物标志物的检测及动态成像

作者：徐蜀妍济南大学

学位级别：硕士

dna传统上被认为是生命系统中的核心遗传因子和生命的蓝图。由于其具有许多特殊的生物、物理、化学特征,各种形态的dna结构开始被设计出来并作为一种功能材料在许多领域拓展出了具有重要意义的应用,尤其是在生物传感,分子诊断和分子治... 详细信息

dna传统上被认为是生命系统中的核心遗传因子和生命的蓝图。由于其具有许多特殊的生物、物理、化学特征,各种形态的dna结构开始被设计出来并作为一种功能材料在许多领域拓展出了具有重要意义的应用,尤其是在生物传感,分子诊断和分子治疗等领域。相比于无机纳米材料潜在的细胞毒性,dna纳米材料具有天然的的生物相容性和结构稳定性,多碱基的构成意味着dna纳米材料具备高可编程性和可修饰性的特点。除此之外,dna纳米材料优越的细胞内化性能也已经被证实。因此dna纳米材料显示出了作为活细胞递送载体的巨大潜力。首先,针对以往dna三维结构仅用于细胞内或细胞表面物质及生物标志物检测的问题,借助核酸适配体的高亲和性和高灵敏性以及dna三棱柱结构的细胞膜可穿透性的特点,设计了基于适配体的dna三棱柱纳米探针（A-DTPNs）用于对细胞表面及细胞内两个位置的生物标志物进行两阶段动态检测及细胞分层成像。在有细胞膜上蛋白PTK7存在时,探针上修饰的适配体Sgc8c可与其特异性结合并通过链置换反应释放互补链与探针报告模块上修饰有荧光基团的dna单链互补配对并释放其被淬灭基团淬灭的荧光信号从而实现探针第一阶段对细胞膜上生物标志物的识别并成像的目的。其后,借助dna三棱柱结构优越的内化性能,使探针的剩余部分通过小窝蛋白的内吞作用进入细胞,实现探针上适配体P53对细胞质内p53蛋白的特异性识别及结合,从而使适配体P53的互补序列得到释放与报告模块中另一单链结合,恢复荧光基团的信号。另外,通过研究探针在不同细胞中获得的荧光图像对探针的特异性识别进行了验证,通过酶的消化和在不同生物系统中的荧光恢复情况探索了探针的稳定性。最后通过共聚焦显微镜荧光成像分析可以看出本研究中设计的（A-DTPNs）能够实现对细胞表面及细胞内部两位置的生物标志物进行分步识别和动态成像的目的,本研究对dna纳米技术的应用,特别是在癌症标志物检测方面提供创新思路。其次,由于单发射的荧光探针是通过监测单个发射峰的强度来实现对目标物质的检测,这种方法很容易受到外界环境的影响产生较高的背景信号以及假阳性的实验结果。相比之下,比率荧光是通过记录两个不同位置的发射峰并计算其比值的方法来实现对目标物质的分析。这种方法能够有效降低外界环境的影响,可以避免由探针浓度,仪器灵敏度等问题所造成的影响,获得更加准确的实验结果。因此,在dna三棱柱结构的基础上设计的一体化dna三棱柱比率探针,可以实现对细胞表面及细胞内不同位置的一氧化氮合酶3的检测和成像。以dna三棱柱为探针主体,连接两个比率型荧光探针作为报告模块,适配体AS411识别细胞膜表面蛋白并促进细胞内化使含有胆固醇的比率探针脱落并锚定在细胞膜上,通过NO敏感的二氨基罗丹明识别NO并计算其与参比荧光信号的比值作为膜上信号,随着dna三棱柱结构的内化作用及适配体MUC1的靶向作用,剩余的探针进入细胞内并识别在高尔基体反向网络上的NO,产生第二个比率信号。由于二氨基罗丹明对NO的高敏感性,以及dna三棱柱结构对细胞膜的高可渗透性和适配体的高亲和性,一体化dna三棱柱比率探针表现出了出色的NO识别能力,成功实现对活细胞中一氧化氮合酶位置的成像。最后,本论文关于dna三棱柱纳米探针对活细胞表面及细胞内物质的探索和研究为dna纳米技术在癌症标志物及其他生物标志物的检测和成像提供了有效的方法和创新性的应用,在早期的临床诊断中具有广阔的应用前景并对癌症发现和治疗起到积极的作用。

关键词： dna纳米结构 dna三棱柱 dna纳米探针 dna比率探针生物标志物检测活细胞成像

以壳聚糖/二氧化硅纳米粒子为基质的dna纳米探针的制备及其电化学发光分析特性研究

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以壳聚糖/二氧化硅纳米粒子为基质的DNA纳米探针的制备及其电化学...

作者：姚秀南陕西师范大学

学位级别：硕士

传统的分子识别反应如抗原-抗体、酶-底物等蛋白质之间的反应由于对检测环境条件要求较为严苛,在一定程度上限制了它们在实际应用中的使用范围。为此,近年来科学家又发展出可用于分子识别检测不同物质的核酸探针,但核酸探针分子一般自... 详细信息

传统的分子识别反应如抗原-抗体、酶-底物等蛋白质之间的反应由于对检测环境条件要求较为严苛,在一定程度上限制了它们在实际应用中的使用范围。为此,近年来科学家又发展出可用于分子识别检测不同物质的核酸探针,但核酸探针分子一般自身不具有信号报告的能力,需要用其他信号物质对其进行标记用于传感分子识别事件。而标记核酸探针技术不但费时、价格高,还有影响探针分子识别目标物选择特异性等缺点。为了解决这些问题,科学家将纳米材料与dna探针复合,提出了 dna纳米探针技术。由于纳米材料种类的丰富多样性、材料自身的光、电特异性使得dna纳米探针在分析应用中展现出很好的发展前景。然而,现有的dna纳米探针制备方法多数需要对dna探针进行信号标记或将探针dna分子共价键合固定化于纳米材料表面,这些过程也在一定程度上使得dna纳米探针的制备复杂、费时且价格昂贵。因此,发展新的dna纳米探针制备技术与方法就显得非常重要。本论文的研究工作主要就是围绕这一问题展开的,其主要内容包括综述和研究报告两部分。在综述部分,论文在介绍了 dna纳米探针的概念、特点基础上,重点就dna纳米探针与发光分析方法结合、实现分析检测进行了综述。研究报告由下面两部分组成:1.基于联吡啶钌/壳聚糖/二氧化硅复合纳米粒子的dna纳米探针的制备方法及其应用研究本工作利用了联吡啶钌/壳聚糖/二氧化硅纳米粒子(CRuS NPs)与dna磷酸骨架之间的静电吸附及氢键作用力将dna探针稳定吸附在CRuS NPs表面制成免标记dna纳米探针,并利用多种方法对其进行了表征,结果表明我们制备的dna纳米探针自身具有一定的稳定性和良好的信号重现性。在此基础上我们将此dna纳米探针用于检测miRNA并对其分析应用进行了研究。当没有目标miRNA存在时,被单链dna吸附包裹的纳米粒子表面显电中性,仅少量的纳米粒子可以被吸附到带负电的Nafion/MWNTs修饰玻碳电极表面,因此产生的背景信号较低;而当目标miRNA存在时,互补序列之间发生碱基互补配对形成刚性双链,在纳米粒子表面的吸附能力变差而脱落下来,失去dna保护的纳米粒子由于自身弱正电性被吸附到电极表面并产生强的电化学发光信号从而达到检测miRNA的目的。实验结果证明我们制备的dna纳米探针可以高灵敏、高选择性的检测低至0.03 pM的目标miRNA并可被用于人血清样品中miRNA的实际检测。2.基于壳聚糖/光泽精/二氧化硅纳米粒子制备的dna纳米探针及其电化学发光分析应用研究光泽精是一种传统的化学发光及电化学发光分析试剂。本部分工作将光泽精包埋在壳聚糖/二氧化硅纳米粒子中制成光泽精/壳聚糖/二氧化硅纳米粒子(CLS NPs)然后将其制备成dna纳米探针并用于miRNA的检测。由于包埋在二氧化硅纳米粒子内部的光泽精无法与检测介质有效接触,发光效率较低。为了解决这一问题,我们利用HF对修饰在电极表面的CLS NPs进行原位刻蚀使其在强碱性检测液中实现高效的电化学发光,提高了检测的灵敏度。实验结果表明该纳米探针对目标miRNA具有很好的选择特异性,信号重现性好,电化学发光信号与目标miRNA浓度在0.1-0.9pM范围成良好的线性关系,并被成功用于人血清样品中目标miRNA的检测。

关键词： dna纳米探针二氧化硅纳米粒子联吡啶钌光泽精电化学发光 miRNA

端粒酶激活型dna纳米探针的构建与诊疗应用

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端粒酶激活型DNA纳米探针的构建与诊疗应用

作者：黄静南京大学

学位级别：硕士

端粒酶是一种逆转录核糖核蛋白酶,可以催化合成端粒重复序列,维持基因组稳定性和细胞活力。正常体细胞几乎不表达端粒酶,而85%以上的癌细胞会激活端粒酶,使癌细胞保持无限增殖的能力。端粒酶作为一种重要的肿瘤标志物,发展快速灵敏检测... 详细信息

端粒酶是一种逆转录核糖核蛋白酶,可以催化合成端粒重复序列,维持基因组稳定性和细胞活力。正常体细胞几乎不表达端粒酶,而85%以上的癌细胞会激活端粒酶,使癌细胞保持无限增殖的能力。端粒酶作为一种重要的肿瘤标志物,发展快速灵敏检测其活性的方法有助于癌症诊断和抗癌药物筛选,设计端粒酶活性响应的治疗方法能提高癌症治疗的特异性。近年来,dna纳米探针以其可编程性、易于修饰和刺激响应性吸引了越来越多的研究关注。本论文结合端粒酶的生物功能和dna纳米探针的特点,分别设计了一种端粒酶激活的dna walker用于端粒酶活性检测和端粒酶激活的dna复合纳米探针用于癌症诊疗。具体工作如下:(1)设计了一种端粒酶激活的三维dna walker并将其用于端粒酶活性检测。此dna walker以金纳米粒子作为三维支架,在其上连接了一个二组分的dna超茎环结构和轨道链。dna超茎环结构包括了摆臂链和作为端粒酶识别元素的端粒酶引物链。通过端粒酶对其引物链的识别和延长,诱导dna超茎环结构发生链取代反应,激活dna walker的摆臂链。进而摆臂链能与轨道链结合,形成限制性核酸内切酶的识别切割位点,经酶切后释放出修饰了荧光分子的轨道链片段。同时摆臂链能继续与周围轨道链结合,经过酶切-释放-结合的循环过程,放大荧光信号。我们将这种dna walker用于多种类型的癌细胞裂解液中进行端粒酶活性检测,检测限可达到90 cellsμL,证明了该dna walker能够高灵敏高特异性地检测端粒酶活性。本工作不仅展示了新颖的端粒酶激活型dna walker的构建方法,也为dna纳米机器在生物传感中的应用提供了新思路。(2)构建了能对肿瘤微环境级联响应的dna复合纳米探针并将其用于癌症治疗。该复合纳米探针具有三层结构,从里到外分别是端粒酶响应的功能化金纳米粒子(f Au)、酸性响应的金属有机骨架和过氧化氢响应的金属多酚配合物。在肿瘤微环境中,金属多酚配合物会与过氧化氢反应,生成高度活泼的羟基自由基,同时释放出来的一种绿茶茶多酚EGCG能够下调药物外排泵蛋白的表达。中间层金属有机骨架在酸性条件下会发生裂解,暴露f Au。端粒酶会识别并延长f Au上的dna引物链,引发dna链取代反应,释放出化疗药物。此复合探针可高效诱导细胞凋亡,激活caspase-3酶,并切割f Au上的底物肽,恢复原先被猝灭的荧光,实现对疗效的实时监控。实验表明这种能对肿瘤微环境级联响应的药物释放策略可以实现癌细胞的靶向给药,且结合化学动力学治疗和绿茶茶多酚抑制药物外流的功能,对耐药性癌细胞也有很好的治疗效果。此工作展现了肿瘤微环境级联响应和端粒酶激活药物释放的策略在肿瘤靶向给药和复合疗法方面的巨大潜力。

关键词：生物传感端粒酶荧光检测 dna纳米探针信号放大

基于核酸探针的荧光生物传感器用于细胞内mRNA和pH成像

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基于核酸探针的荧光生物传感器用于细胞内mRNA和pH成像

作者：李婉宁湖南大学

学位级别：硕士

生命科学技术的发展与生活中的疾病诊断治疗、食品品质安全及环境卫生等领域息息相关,如何利用生命科学技术来提高“生活质量”是全球研究工作亟待解决的问题之一。生物传感器技术是非常活跃的多学科领域交叉分析技术,可用于连续、快速... 详细信息

生命科学技术的发展与生活中的疾病诊断治疗、食品品质安全及环境卫生等领域息息相关,如何利用生命科学技术来提高“生活质量”是全球研究工作亟待解决的问题之一。生物传感器技术是非常活跃的多学科领域交叉分析技术,可用于连续、快速和灵敏地监控这些领域的关键参数。纳米材料与技术的发展赋予生物传感器独特的光学性质和机械稳定性等优势,为研究者们在分子水平上更加深入地探索生物传感器。近年来,生物传感器与核酸信号放大技术和dna纳米结构自组装技术相结合,为细胞内的检测提供了有效策略,推动了生物传感器在复杂生物环境中的发展。本文结合核酸等温无酶信号放大技术和dna纳米结构自组装方法,建立了肿瘤相关mRNA和pH的荧光生物传感新方法,实现了活细胞内目标分析物的检测与成像。具体研究内容如下:一、催化发夹组装dna探针用于活细胞内肿瘤相关的mRNA成像信使RNA(mRNA)是一种低丰度的疾病早期诊断生物标志物,在生命过程中扮演着重要角色。mRNA的表达水平能够为医学诊断提供有价值的信息,因此发展活细胞内快速准确检测分析mRNA的策略十分必要。在第2章中,我们设计了一种无酶信号放大的生物传感平台,利用催化发夹组装技术(catalytic hairpin assembly,CHA)进行荧光信号增强,实现了活细胞中肿瘤相关的mRNA成像检测。基于CHA的生物传感器主要依赖于H1和H2两个发夹探针。H1与mRNA杂交互补的碱基序列修饰有荧光团和猝灭团。当体系中不存在目标mRNA时,发夹由于自身碱基序列杂交成环而保持稳定的结构存在于溶液中,荧光被有效猝灭。一旦体系中出现目标mRNA,可引发两个发夹探针杂交组装,产生CHA放大反应,恢复荧光。当两个发夹进入活细胞,细胞内所含有的低丰度目标mRNA激活CHA反应,产生多个双链产物以响应单个mRNA,在活细胞内进行mRNA的检测与成像。因此这种基于CHA信号放大的生物传感器可作为疾病早期诊断的有效工具。二、dna纳米探针用于活细胞成像pH是生命体的重要生理参数,与各种细胞事件和生命活动密切相关。pH的微弱变化会对生命进程中的新陈代谢活动产生巨大的影响,不仅会打破体内稳态平衡,还会引起生理活动失常。为解决这一问题,在第3章中,我们发展了一种可逆的刺激响应型dna纳米探针,用于细胞内pH成像。dna纳米探针生物传感器由两种Y形dna双链组装模块(Ya和Yb)和一种线性dna linker双链的连接模块(linker)构成。其中,linker含有猝灭剂标记的i-motif链和对应的互补链,互补链则用荧光团标记。弱酸条件下,i-motif链折叠成C四链体,从dna纳米结构骨架上分离,荧光恢复,处于“信号打开”的状态;当体系处于弱碱性条件时,linker不会发生构象变化,且保持着刚性的双链螺旋结构,因而具有完整的dna纳米结构,此时荧光团和猝灭团由于紧密邻近,荧光被有效猝灭,dna纳米探针可以快速响应pH波动。这种设计赋予dna纳米探针高灵敏的局部荧光响应,而且dna纳米探针在生理pH范围内表现出可逆的动态响应,显示了其在体外检测和活细胞成像方面的优势。因此基于dna纳米探针的生物传感平台在pH相关的疾病诊断、药物控释体系及其他领域有着巨大的潜力。

关键词：荧光生物传感器核酸等温扩增技术 dna纳米探针 mRNA pH

dna探针修饰的上转换纳米粒子在miRNA检测中的应用

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DNA探针修饰的上转换纳米粒子在miRNA检测中的应用

作者：李志豪内蒙古大学

学位级别：硕士

microRNAs(miRNAs)是一种典型的肿瘤标志物,miRNAs的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后判断具有重要的意义。在目前的miRNAs检测方法中,荧光修饰dna纳米器件由于设计方法简单且灵敏度较高被广泛的应用于多种生物标志物的检测中。传统的DN... 详细信息

microRNAs(miRNAs)是一种典型的肿瘤标志物,miRNAs的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后判断具有重要的意义。在目前的miRNAs检测方法中,荧光修饰dna纳米器件由于设计方法简单且灵敏度较高被广泛的应用于多种生物标志物的检测中。传统的dna纳米器件在检测miRNAs时是处于一直活跃的状态,容易在运送的过程中产生信号,不能真实准确的反应指定地点的miRNAs信号,导致dna纳米器件的成像分辨率较低。光解键(PC-Linker)的出现让可控dna纳米器件成为可能,修饰光解键的dna纳米器件可以实现紫外光辐射激活,而无辐射时保持沉默状态。但是紫外光的深层组织穿透能力弱,光损伤大且会产生强的荧光背景不能作为辐射光源直接激活细胞或体内的dna纳米器件。稀土掺杂上转换纳米粒子具有独特的发光性质,可以将近红外光转换为紫外光,由于是近红外光激发,所以上转换纳米粒子具有组织穿透能力强、光损伤低及光漂白效果弱等优点,同时还具有较好的生物相容性和较高的稳定性,是体内控制成像miRNAs的理想材料,为体内的激活和成像提供了一个新的方向。将光控dna纳米器件与有独特发光特性的上转换纳米粒子相结合,可以实现高精度时空控制的miRNAs检测。本文中,我们通过高温热分解法合成了高质量的Na YF:Yb/Tm@Na Gd F:Yb核壳上转换纳米粒子,并将该纳米粒子作为dna纳米探针的载体和光激活剂,构建了一种miRNAs的传感平台。在上转换纳米粒子的制备、dna探针的设计和修饰及传感器的搭建方面展开了研究,主要成果简述如下:(1)以稀土乙酸盐为原料,通过改进的高温热分解法合成了纯六方相的Na YF:Yb/Tm@Na Gd F:Yb核壳结构,粒径约为44nm,分散性好且大小均一;相对于单独的核结构有明显的发光增强,在近红外光的激发下产生较强的紫外区发光。(2)创新性的设计了两种dna纳米探针:双检测dna探针和四检测dna探针(dna风车),并通过大量的实验探究了双检测dna探针的最佳形态,选择双检测dna纳米探针用于构建miRNAs传感器。(3)通过与聚-D-赖氨酸(PDL)的静电相互作用将dna纳米探针负载到纳米粒子的表面,构建了miRNAs传感器。(4)在miRNAs传感器的血清实验中,证明了上转换纳米粒子对dna探针有较好的保护效果。本项工作有望用于体内外多种miRNAs的同时检测。

关键词：上转换纳米粒子 dna纳米探针 miRNA 传感器

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近红外光激活的纳米探针用于细胞内精准检测

近红外光激活的纳米探针用于细胞内精准检测